ซากาโมโตะ เรียวมะ เสียชีวิตจากการถูกลอบสังหารเมื่อ ค.ศ. 1867 ที่ ร้านโอมิยะ (近江屋) ในกรุงเกียวโต พร้อมกันกับนากาโอกะ ชินตาโร ผู้เป็นพี่น้องร่วมสาบาน เหตุการณ์ดังกล่าวเกิดขึ้นก่อนหน้าการปฏิรูปเมจิจะเกิดขึ้นไม่นานนัก รายงานการสอบสวนในชั้นต้นกล่าวหาว่า เหตุฆาตกรรมดังกล่าวเป็นฝีมือของกลุ่มชินเซ็งงูมิ (ภายหลังคนโด อิซามิ ผู้นำของชินเซ็งงูมิซึ่งพ่ายแพ้แก่ฝ่ายซัตสึมะและโจชูในนามกองทัพของพระจักรพรรดิและถูกจับเป็นเชลย ได้ถูกประหารชีวิตด้วยข้อกล่าวหาข้างต้น) ทว่ากลุ่มที่สนับสนุนโชกุนอีกกลุ่มหนึ่ง คือ กลุ่มมิมาวาริงูมิของอิมาอิ โนบูโอะ ได้สารภาพในปี ค.ศ. 1870 ว่าเป็นผู้ลงมือก่อเหตุดังกล่าว แม้ว่าซาซากิ ทาดาซาบูโร และอิมาอิ โนบูโอะ จะเป็นผู้ที่ถูกประณามจากเรื่องนี้ แต่ไม่มีการพิสูจน์สอบสวนในกระบวนการยุติธรรมว่าฆาตกรตัวจริงเป็นใครแต่อย่างใด[7]

สำหรับอายุของเรียวมะขณะที่เสียชีวิตนั้น หากคำนวณตามปฏิทินจันทรคติเก่าของญี่ปุ่น เรียวมะจะมีอายุได้ 33 ปี (เกิดในวันที่ 15 เดือน 11 ค.ศ. 1835 เสียชีวิตในวันคล้ายวันเกิดในปี ค.ศ. 1867) แต่เมื่อนับตามปฏิทินสุริยคติระบบปฏิทินเกรกอเรียน เขาจะมีอายุเพียง 31 ปีเท่านั้น