นาตาลี พอร์ตแมนเกิดในกรุงเยรูซาเลม ประเทศอิสราเอล พออายุ 3 ขวบได้ย้ายตามครอบครัวไปอยู่ที่ประเทศสหรัฐอเมริกา พ่อของพอร์ตแมนเป็นหมอ แม่เป็นศิลปิน ขณะที่เธอมีอายุได้เพียง 10 ขวบ บริษัทโมเดลลิ่งแห่งหนึ่งมาเห็นแววเธอเข้าที่ร้านพิซซ่า พอร์ตแมนไม่เคยเรียนการแสดง แต่เธอก็ได้รับเลือกให้เล่นบท มาทิลดา ในภาพยนตร์ของ ลุก แบซง เรื่อง Léon: The Professional (ลีออง เพชฌฆาตมหากาฬ) เมื่อปี ค.ศ. 1994 และได้รับคำชื่นชมจากบรรดานักวิจารณ์

ต่อมาในปี ค.ศ. 1995 พอร์ตแมนได้ร่วมแสดงในภาพยนตร์ของ ไมเคิล มานน์ เรื่อง Heat ซึ่งได้แสดงร่วมกับดารารุ่นใหญ่อย่าง โรเบิร์ต เดอนิโร และ อัล ปาชิโน ตามด้วยภาพยนตร์เรื่องอื่นๆต่อมา ในปี ค.ศ. 1996 ได้แก่ Beautiful Girls, Everyone Says I Love You และ Mars Attacks!

ในปี ค.ศ. 1997 พอร์ตแมนได้รับเลือกให้แสดงในบทบาทของ แพดเม่ อมิดาลา ราชินีแห่งนาบู ซึ่งเป็นบทบาทสำคัญในไตรภาคต้นของมหากาพย์ภาพยนตร์ชุด สตาร์ วอร์ส โดยได้เริ่มถ่ายทำภาคแรก คือ สตาร์ วอร์ส เอพพิโซด 1: ภัยซ่อนเร้น (Star Wars: Episode I - The Phantom Menace) ในเดือนมิถุนายน ค.ศ. 1997 และออกฉายในเดือนพฤษภาคม ค.ศ. 1999 รวมถึงอีก 2 ภาคต่อมา ได้แก่ สตาร์ วอร์ส เอพพิโซด 2: กองทัพโคลนส์จู่โจม (Star Wars: Episode II - Attack of the Clones) ในปี ค.ศ. 2002 และ สตาร์ วอร์ส เอพพิโซด 3: ซิธชำระแค้น (Star Wars: Episode III - Revenge of the Sith) ในปี ค.ศ. 2005

ในปี ค.ศ. 1999 พอร์ตแมนได้ร่วมแสดงในภาพยนตร์เรื่อง Anywhere But Here ร่วมกับ ซูซาน ซาแรนดอน ซึ่งทำให้เธอได้รับการเสนอชื่อเข้าชิงรางวัลลูกโลกทองคำเป็นครั้งแรก ในสาขานักแสดงสมทบหญิงยอดเยี่ยม

ในปี ค.ศ. 2000 พอร์ตแมนได้แสดงภาพยนตร์เรื่อง Where the Heart Is ซึ่งหลังจากถ่ายทำภาพยนตร์เรื่องนี้เสร็จ เธอได้เข้าศึกษาต่อในระดับปริญญาตรี สาขาจิตวิทยา ที่มหาวิทยาลัยฮาร์วาร์ด และได้ย้ายเข้าสู่หอพักนักศึกษาของมหาวิทยาลัย โดยเธอได้ใช้ช่วงเวลาในระหว่างปิดเทอมฤดูร้อน (มิถุนายน-กันยายน ค.ศ. 2000) ในการถ่ายทำภาพยนตร์เรื่อง สตาร์ วอร์ส ในภาคที่ 2

ในปี ค.ศ. 2001 พอร์ตแมนได้ร่วมเป็นนักแสดงรับเชิญในภาพยนตร์เรื่อง Zoolander รวมถึงในปี ค.ศ. 2003 กับบทบาทเล็กๆในภาพยนตร์เรื่อง Cold Mountain ต่อมาในปี ค.ศ. 2004 พอร์ตแมนได้ร่วมแสดงในภาพยนตร์เรื่อง Garden State ซึ่งภาพยนตร์เรื่องนี้ถูกเลือกให้ฉายในเทศกาลภาพยนตร์ซันแดนซ์ (Sundance Film Festival) และในปีเดียวกัน เธอได้ร่วมแสดงในภาพยนตร์เรื่อง Closer ร่วมกับ จูเลีย โรเบิตส์, จู๊ด ลอว์ และ ไคลฟ์ โอเวน ซึ่งบทบาทจากภาพยนตร์เรื่องนี้เอง ทำให้พอร์ตแมนได้รับการเสนอชื่อเข้าชิงรางวัลลูกโลกทองคำเป็นครั้งที่ 2 รวมถึงได้รับการเสนอชื่อเข้าชิงรางวัลออสการ์เป็นครั้งแรก ในสาขานักแสดงสมทบหญิงยอดเยี่ยมอีกด้วย

ในปี ค.ศ. 2005 พอร์ตแมนได้ร่วมแสดงในภาพยนตร์ สตาร์ วอร์ส ในภาคที่ 3 ซึ่งเป็นภาคสุดท้ายในชุดไตรภาคต้น ภาพยนตร์เรื่องนี้ทำรายได้ในประเทศสูงที่สุดของปี และได้รับรางวัลภาพยนตร์ยอดนิยม (Favorite Motion Picture) จากรางวัล People's Choice Awards ซึ่งมาจากการโหวตของผู้ชม

ในปี ค.ศ. 2006 หลังจากที่จบจากการถ่ายทำภาพยนตร์ชุด สตาร์ วอร์ส ทั้ง 3 ภาคแล้ว พอร์ตแมนยังคงมีผลงานภาพยนตร์ออกมาต่อเนื่อง ได้แก่ Free Zone, Goya's Ghosts และ V for Vendetta ซึ่งจากบทบาทในภาพยนตร์เรื่อง V for Vendetta ที่เธอได้ร่วมแสดง ทำให้พอร์ตแมนได้รับรางวัลแซทเทิร์น สาขานักแสดงนำหญิงยอดเยี่ยมอีกด้วย

ในช่วงปลายปี ค.ศ. 2006 พอร์ตแมนได้รับแสดงภาพยนตร์เรื่อง The Other Boleyn Girl (บัลลังก์รัก ฉาวโลก) ซึ่งเธอรับบทบาทเป็น แอนน์ โบลีน พระราชินีแห่งอังกฤษ โดยได้ร่วมแสดงกับ สการ์เลตต์ โจแฮนส์สัน และ อีริก บานา ภาพยนตร์เรื่องนี้ได้ออกฉายในปี ค.ศ. 2008

ในปี ค.ศ. 2010 พอร์ตแมนได้ร่วมแสดงในภาพยนตร์เรื่อง Black Swan (แบล็ค สวอน) ของผู้กำกับ ดาร์เรน อโรนอฟสกี โดยในภาพยนตร์เรื่องนี้เธอต้องรับบทบาทเป็นนักเต้นบัลเลต์ ทำให้เธอต้องซ้อมเต้นบัลเลต์อย่างหนัก วันละ 5-8 ชั่วโมง เป็นระยะเวลาถึง 6 เดือน และลดน้ำหนักลงไป 20 ปอนด์ (9 กิโลกรัม) ซึ่งจากบทบาทนี้เอง ที่ทำให้เธอคว้ารางวัลด้านการแสดงในสาขานักแสดงนำหญิงยอดเยี่ยมแทบทุกสถาบัน รวมไปถึงรางวัลลูกโลกทองคำ, รางวัลสมาคมนักแสดงภาพยนตร์และโทรทัศน์, รางวัลแบฟตา และรางวัลออสการ์ด้วย

ในปี ค.ศ. 2011 พอร์ตแมนได้ร่วมแสดงในภาพยนตร์เรื่อง No Strings Attached (จะกิ๊กหรือกั๊ก ก็รักซะแล้ว) ร่วมกับ แอชตัน คุชเชอร์ ซึ่งในภาพยนตร์เรื่องนี้เธอได้มีส่วนร่วมเป็นผู้อำนวยการผลิต (Executive Producer) ด้วย และในปีเดียวกัน เธอได้ร่วมแสดงในภาพยนตร์เรื่อง Thor (ธอร์ เทพเจ้าสายฟ้า) ซึ่งเป็นภาพยนตร์แนวซุปเปอร์ฮีโร่ ร่วมกับ คริส เฮมสวอร์ธ และ ทอม ฮิดเดิลสตัน

ในปี ค.ศ. 2013 พอร์ตแมนได้กลับมารับบทบาทเดิมอีกครั้งในภาพยนตร์ภาคต่อ Thor: The Dark World (ธอร์ เทพเจ้าสายฟ้าโลกาทมิฬ) และได้แสดงฝีมือในการกำกับภาพยนตร์เป็นครั้งแรก กับภาพยนตร์ที่ชื่อว่า A Tale of Love and Darkness ซึ่งเป็นภาพยนตร์ที่สร้างโดยดัดแปลงจากหนังสืออัตชีวประวัติของนักเขียนชาวอิสราเอล อามอส ออซ โดยเธอทั้งรับหน้าที่โปรดิวเซอร์, ผู้กำกับ, ผู้เขียนบท และร่วมแสดงในภาพยนตร์เรื่องนี้เองด้วย ภาพยนตร์เรื่องนี้ได้รับเลือกให้ฉายในงานเทศกาลหนังเมืองคานส์ ในปี ค.ศ. 2015

ในเดือนพฤษภาคม ค.ศ. 2015 พอร์ตแมนได้รับแสดงภาพยนตร์เรื่อง Jackie โดยเธอรับบทบาทเป็น แจ็กเกอลีน เคนเนดี โอนาสซิส อดีตสุภาพสตรีหมายเลขหนึ่งของสหรัฐอเมริกา ซึ่งภาพยนตร์เรื่องนี้ได้ออกฉายในปี ค.ศ. 2016