ป่ากุยบุรีมีความหลากหลายทางระบบนิเวศทางชีวภาพสูง ประกอบด้วย สังคมพืช ที่มีความโดดเด่นได้แก่ ป่าดิบแล้ง พบกระจายอยู่ทั่วไป ครอบคลุมพื้นที่ส่วนใหญ่ของอุทยานแห่งชาติกุยบุรี ป่าดิบเขา พบกระจายเป็นพื้นที่เล็กๆตามสันเขา ยอดเขาสูงชันทางด้านทิศตะวันตก ป่าดิบชื้นพบตามริมลำห้วย ป่าผสมผลัดใบพบกระจายบางพื้นที่ทางด้านตะวันออก ส่วนตอนกลางของพื้นที่ของบริเวณหน่วยพิทักษ์อุทยานแห่งชาติที่กร.1 (ป่ายาง) เป็นพื้นที่ฟื้นฟูสภาพป่า ปลูกพืช อาหารสัตว์ และพื้นที่จัดการทุ่งหญ้าเพื่อเป็นอาหารสัตว์ป่า มีการสร้างแหล่งน้ำทั้งในรูปฝายเก็บน้ำ และฝายต้นน้ำเพื่อรักษาความชุ่มชื้นให้ผืนป่าตามโครงงานการอนุรักษ์และฟื้นฟูสภาพป่าสงวนแห่งชาติป่ากุยบุรี อันเนื่องมาจากพระราชดำริจากการที่เป็นผืนป่ารอยต่อระหว่างภาคใต้และภาคกลาง ทั้งยังอยู่ในเทือกเขาตะนาวศรีจึงมีความหลากหลายของพืชพรรณสูงมากแห่งหนึ่งอันเป็นเอกลักษณ์ของพื้นที่แห่งนี้ พบเหรียงหรือต้นกะเหรี่ยงไม้สกุลสะตอ ได้บริเวณป่าดิบแล้งไม้ภาคใต้ในป่าดิบชื้นทางตอนเหนือออกฝักช่วงฤดูฝน ถิ่นกำเนิดไม้หอมหลายชนิด เช่น ไม้จันทร์หอม ไม้หอมในพระราชพิธีสำคัญ ไม้มหาพรหมไม้ป่า ดอกไม้สวยงาม ไม้ยางนา ไม้ยางแดง มะด่าโมง ตะเคียนทอง มะปรางป่าตอนเหนือของอุทยานฯ เป็นแหล่งรวบรวมพันธ์หวายธรรมชาติ เช่นหวายตะเค้าทองกล้วยไม้กว่า 60 ชนิด ส่วนใหญ่พบออกดอกในช่วงเดือนกุมพาพันธ์ถึงมิถุนายน กล้วยเด่นหวายแดงประจวบคีรีขันธ์ เอื้องวนิลา ไม้ดอกหอมที่พบกระจายพันธุ์เฉพาะถิ่นใต้ กล้วยไม้หางช้าง หรือ ว่านเพชรหึง ซึ่งเป็นกล้วยไม้ที่ใหญ่ที่สุดในโลก

นอกจากนี้อุทยานแห่งชาติกุยบุรียังเป็นถิ่นที่อยู่อาศัยของสัตว์ป่าที่มีความสำคัญต่อการอนุรักษ์ในระดับชาติ ระดับภูมิภาค และระดับโลก เช่น ช้างเอเชีย (Elephas maximus), เสือโคร่ง (Panthera tigirs), วัวแดง (Bos javanicus), กระทิง (Bos gaurus), สมเสร็จ (Topirus indicus), เก้งหม้อ (Muntiacus teae), หมีควาย (Ursus Thibetanus), เสือลายเมฆ (Neofells nebulosa), เสือไฟ (Capricornis temminickki) เสือดำ, เสือดาว (Panthera pardur), เสือปลา (Prionailurus viverrinus), หมีหมา (Ursus malayanus), หมาใน (Cuon alpinus), ชะมดแปลงลายแถบ (Prionodon linsang), เลียงผา (Capricornis sumatraensis), นกเงือกกรามช้างปากเรียบ (Rhyticeros subruficollis), ไก่ฟ้าหน้าเขียว (Lophura ifnita) ซึ่งล้วนอยู่ในวิกฤติของการสูญพันธุ์ทางธรรมชาติ และพันธุ์พืช เช่น ต้นจันทน์, ต้นยางนา, ต้นเหรียง, ต้นเปล้าน้อย, หวายตะค้าทอง, ต้นเอื้องวานิลลา เป็นต้น