โทบรามัยซินออกฤทธิ์ยับยั้งการสังเคราะห์โปรตีนของแบคทีเรีย โดยเข้าจับกับหน่วยย่อย 30 เอส และหน่วยย่อย 50 เอสของไรโบโซมแบคทีเรียเพื่อรวมกันเป็น 70 เอสไรโบโซม ทำให้เอ็มอาร์เอ็นเอไม่สามารถแปลรหัสพันธุกรรมเพื่อสร้างโปรตีนที่จำเป็นต้องการดำรงชีวิตและการเพิ่มจำนวนได้ ส่งผลให้เซลล์แบคทีเรียนั้นๆตายในที่สุด จากการศึกษาของ Kotra และคณะ พบว่ายากลุ่มอะมิโนไกลโคไซด์ ซึ่งรวมถึงโทบรามัยซินจะมีหมู่เอมีนที่มีการรับโปรตอนเข้ามาจนเกิดเป็นประจุบวกจำนวนมากในโมเลกุล ซึ่งประจุที่เกิดขึ้นนี้จะมีความจำเพาะในการจับกับนิวคลีโอไทด์เป็นอย่างมาก โดยเฉพาะอย่างยิ่งในเซลล์โพรแคริโอต นอกจากนี้แล้วยากลุ่มอะมิโนไกลโคไซด์ยังสมารถจับกับไรโบไซม์หัวค้อน (hammerhead ribozyme), เฟนิลอะลานีน—ทีอาร์เอ็นเอ (Phenylalanine—tRNA), HIV Rev response element, ไรโบไซม์จากไวรัสตับอักเสบ ดี, และ Group I catalytic intron ได้ด้วย[5]