การติดตัวติดตามบนดีเอ็นเอ ขั้นแรกหลังจากทำบริสุทธิ์ดีเอ็นเอแล้วนำดีเอ็นเอมาทำการหั่นให้ได้ดีเอ็นเอชิ้นเล็กๆแบบสุ่มโดยใช้เอ็นไซม์ทรานโพเอส (Transposases) จากนั้นจะนำอะแดปเตอร์ต่อเข้ากับปลายทั้งสองข้างของดีเอ็นเอที่ถูกตัด(กระบวนการไลเกชั่น) ส่วนสายที่ไม่ถูกต่อด้วยอะแดปเตอร์ จะถูกล้างออกไป[3]

Reduced cycle amplification เป็นขั้นตอนที่เติม adapters ซึ่งประกอบด้วย Primer binding, indices และTerminal sequence ให้กับสายดีเอ็นเอแม่แบบโดยที่ indices ส่วนใหญ่มีความยาว 6 เบสใช้เพื่อแยกดีเอ็นเอตัวอย่างแต่ละชิ้นในระหว่างการหาลำดับนิวคลีโอไทด์ตัวอย่าง โดย indices ที่ใช้จะมีลำดับแต่แตกต่างกันถึง 96 แบบ ซึ่งเมื่อคอมพิวเตอร์ทำการวิเคราะห์จะทำการรวมกลุ่ม indices ที่เหมือนกันเข้าด้วยกันแล้ววิเคราะห์ Terminal sequence ใช้เพื่อให้ดีเอ็นเอยึดกับ flow cell ซึ่งใน flow cell มีลำดับนิวคลีโอไทด์สายสั้นๆเคลือบอยู่ส่วนฐานของ flow cell ซึ่งทำหน้าที่ยึดกับดีเอ็นเอไว้กับที่ในระหว่างที่ทำการหาลำดับนิวคลีโอไทด์ Terminal sequence สองแบบจะถูกเติมให้กับดีเอ็นเอ เมื่อดีเอ็นเอเข้าสู่ flow cell adapter แต่ละตัวก็จะจับกับนิวคลีโอไทด์ที่อยู่บนฐานของ flow cell

Bridge amplification หลังจากที่ดีเอ็นเอตัวอย่างลงจับกับนิวคลีโอไทด์บนฐานของ flow cell cluster generation จะเกิดขึ้นเพื่อที่จะสร้างดีเอ็นเอที่มีหน้าตาเหมือนดีเอ็นเอตัวอย่างทุกประการจำนวนมากโดยดีเอ็นเอที่ได้จะมีทั้งสาย forward strands และ reverse strands โดยที่เอ็นไซม์พอลีเมอเรสเคลื่อนที่ไปตามดีเอ็นเอตัวอย่างเพื่อสร้างดีเอ็นคู่สม จากนั้นจะทำการล้างดีเอ็นเอตัวอย่างทิ้งไปโดยจะเหลือเส้น reverse strands ที่ติดกับ flow cell เท่านั้นที่ส่วนบนสุดของสายดีเอ็นเอ reverse strands มี adapters ลำดับนิวคลีโอไทด์ที่สามารถจับกับนิวคลีโอไทด์บนฐานของ flow cell ได้จากนั้นเอ็นไซม์พอรีเมอเรสจับกับ reverse strands เพื่อสร้างสายดีเอ็นเอคู่สมซึ่งดีเอ็นเอคู่สมจะมีลำดับนิวคลีโอไทด์เหมือน forward strands จากนั้นทำการแยกสายของดีเอ็นเอออกจากกันเพื่อให้ดีเอ็นเอจับกับนิวคลีโอไทด์ที่อยู่บนฐานของ flow cell แล้วเกิดการต่อสายดีเอ็นเอขึ้น ซึ่งกระบวนการนี้เป็นการต่อสายดีเอ็เอหลายพันกลุ่มได้ในครั้งเดียว

Clonal amplification ดีเอ็นเอจะเกิดการโค้งงอและยึดติดกับนิวคลีโอไทด์ที่อยู่บนฐานของ flow cell เรื่อยๆโดยเอ็นไซม์พอลีเมอเรสจะสังเคราะห์เพื่อสร้างสายดีเอ็นเอคู่สม(เกลียวคู่)จากนั้นจะถูกทำให้แยกสายเพื่อให้ดีเอ็นเอทั้งเส้น forward strands และ reverse strands ยึดติดกับนิวคลีโอไทด์ที่อยู่บนฐานของ flow cell ที่ตำแหน่งข้างเคียง โดยในขั้น Clonal amplification มีความสำคัญในการควบคุมคุณภาพโดยสามารถตรวจสอบจากเส้น reverse strands ได้โดยที่เส้น forward strands และ reverse strands สามารถใช้ตรวจเช็คเพื่อป้องกันข้อผิดพลาดได้ เนื่องจาก Illumina dye sequencing ใช้เอ็นไซม์ในปฏิกิริยาดังนั้นจึงอาจมีข้อผิดพลาดที่เกิดการแทนที่ได้ โดยเฉพาะที่ด้านปลาย 3’ โดยดีเอ็นเอทั้ง forward strands และ reverse strands ควรมีลำดับนิวคลีโอไทด์ที่เป็นคู่สมกัน ดังนั้นถ้ามีลำดับนิวคลีโอไทด์ที่แตกต่างกันออกไปจะแสดงให้เห็นว่ามีข้อผิดพลาดเกิดขึ้น ซึ่งในห้องปฏิบัติการบางแห่งใช้เกณฑ์ยอมรับขั้นต่ำต้องเหมือนกันอย่างน้อย 97%

การหาลำดับนิวคลีโอไทด์ หลังจากสิ้นสุดขั้นตอน Clonal amplification สายดีเอ็นเอ reverse strands จะถูกตัดและล้างออกให้เหลือแต่ดีเอ็นเอ forward strands Primers จะเกาะกับดีเอ็นเอ forward strands จากนั้น DNA Polymerase จะทำการต่อสายดีเอ็นเอโดยนำนิวคลีโอไทด์ที่ติดตามด้วย Fluorescent โดยจะเกิดการเติมเบสเพียงหนึ่งเบสต่อรอบเท่านั้น ซึ่งในแต่ละนิวคลีโอไทด์จะมีการบล็อคปลาย 3’ (reversible terminator) เพื่อป้องกันการเติมเบสหลายเบสในหนึ่งรอบ โดยในเบสแต่ละแบบจะติดตามด้วย Fluorescent ที่มีสีและค่า emission ที่แตกต่างกันโดยเครื่องจะทำการอ่านสีในแต่ละรอบที่เติมเบส โดยเมื่ออ่านสายดีเอ็นเอแล้วดีเอ็นเอคู่สมที่ถูกสร้างมาจะถูกล้างออก จากนั้นให้ Index 1 primer เข้าจับกับ Index 1 ทำการต่อสาย Index จากนั้นทำการล้างสาย Index 1 ออก จากนั้นทำ Bridge amplification อีกครั้งโดยให้ปลาย3’ของสายดีเอ็นเอจับกับนิวคลีโอไทด์บนฐานของ flow cell เพื่อให้เกิดการต่อสายของดีเอ็นเอ reverse strands เมื่อได้สายดีเอ็นเอ reverse strands จะทำการตัดและล้างดีเอ็นเอ forward strands ออกจากนั้นให้ทำการหาลำดับนิวคลีโอไทด์ซ้ำอีกรอบกับสายดีเอ็นเอ reverse strands

การวิเคราะห์ข้อมูล ลำดับนิวคลีโอไทด์ที่เกิดขึ้นมานับล้านนิวคลีโอไทด์ในครั้งเดียวจะถูกจัดกลุ่มตาม indices ซึ่งในแต่ละกลุ่มจะมีลำดับนิวคลีโอไทด์ที่เหมือนกันประมาณ 1000 ชุด โดยลำดับนิวคลีโอไทด์ที่ได้จากการวิเคราะห์ที่มีลำดับเหมือนกันจะถูกนำมาซ้อนทับกันซึ่งหากมีลำดับนิวคลีโอไทด์อ้างอิงสามารถนำข้อมูลมาเทียบกับลำดับอ้างอิงได้