สเตรปโตมัยซินเป็นยาปฏิชีวนะที่ออกฤทธิ์ยับยั้งการสังเคราะห์โปรตีนของเซลล์แบคทีเรีย โดยยานี้จะเข้าจับกับหน่วยย่อย 30 เอสของไรโบโซมแบคทีเรีย ซึ่งจะส่งผลรบกวนการเข้าจับกันระหว่างฟอร์มิล–เมไธโอนิล–ทีอาร์เอ็นเอ กับหน่วยย่อย 30 เอสดังกล่าว[15] ทำให้การอ่านข้อมูลจากโคดอนผิดพลาด จนนำไปสู่การยับยั้งการสร้างโปรตีนที่จำเป็นต่อการดำรงชีวิตและการเพิ่มจำนวนของเซลล์ ส่งผลให้เซลล์แบคทีเรียนั้นๆตายไปในที่สุด อย่างไรก็ตาม กลไกการออกฤทธิ์โดยละเอียดของสเตรปโตมัยซินนั้นยังไม่เป็นที่ทราบแน่ชัด แต่คาดว่ายานี้จะป้องกันการจับตัวกันเป็น 70 เอสไรโบโซมของหน่วยย่อย 30 เอสและหน่วยย่อย 50 เอส และทำให้การแปลรหัสพันธุกรรมจากเอ็มอาร์เอ็นเอนั้นเกิดการผิดพลาด จนทำให้โปรตีนที่สร้างขึ้นมาเกิดการกลายพันธุ์แบบเฟรมชิฟท์ (frameshift mutation) และเป็นโปรตีนที่ไม่สามารถทำงานได้ ส่งผลให้เซลล์นั้นๆตายไป[16] โดยไรโบโซมในเซลล์ของมนุษย์นั้นมีโครงสร้างที่แตกต่างไปจากไรโบโซมที่พบในแบคทีเรีย ทำให้สเตรปโตมัยซินไม่มีผลต่อเซลล์มนุษย์ หากใช้ยาในขนาดและระยะเวลาที่เหมาะสม ทั้งนี้ ณ ความเข้นข้นต่ำๆ สเตรปโตมัยซินจะออกฤทธิ์เพียงแค่ยับยั้งการจเริญเติบโตของแบคทีเรียเท่านั้น โดยเหนี่ยวนำให้ไรโบโซมแปรรหัสพันธุกรรมจากเอ็มอาร์เอ็นเอผิดพลาด[17] สเตรปโตมัยซินเป็นยาปฏิชีวนะที่ออกฤทธิ์ครอบคลุมทั้งเชื้อแบคทีเรียแกรมบวกและแกรมลบ[18] จึงจัดได้ว่ายานี้เป็นยาปฏิชีวนะที่ออกฤทธิ์กว้างอีกชนิดหนึ่งที่มีประโยชน์อย่างมากในการรักษาโรคติดเชื้อแบคทีเรียชนิดต่างๆ