ไอ้แมงมุมเป็นตัวการ์ตูนยอดมนุษย์อีกตัวหนึ่งที่มีศัตรูจำนวนมาก และศัตรูหลาย ๆ ตัวของเขาก็เป็นที่รู้จักกันอย่างแพร่หลาย โดยศัตรูตัวสำคัญของเรื่องนี้ที่ถือว่ามีความเลวทรามและอันตรายที่สุดก็ได้แก่ กรีนกอบลิน[38] ดอกเตอร์ออกโทปุส (Doctor Octopus) และเวนอม (Venom) ส่วนศัตรูตัวอื่น ๆ ที่มีความสำคัญพอ ๆ กัน ก็ได้แก่ ลิซาร์ด (Lizard) คาเมเลียน (Chameleon) ฮอบกอบลิน (Hobgoblin) แครเวนเดอะฮันเตอร์ (Kraven the Hunter) สกอร์เปียน (Scopion) แซนด์แมน (Sandman) ไรห์โน (Rhino) มิสเทริโอ (Mysterio) วัลเจอร์ (Vulture) อีเล็คโตร (Electro) คาร์เนจ (Carnage) คิงพิน (Kingpin) และช็อคเกอร์ (Shocker) เป็นต้น ศัตรูเหล่านี้ส่วนใหญ่ได้รับพลังพิเศษมาจากอุบัติเหตุจากการทดลองทางวิทยาศาสตร์หรือการนำเทคโนโลยีวิทยาศาสตร์มาใช้ในทางที่ผิด และศัตรูบางตัวยังมีเครื่องแบบและพลังพิเศษเหมือนสัตว์คล้ายกับไอ้แมงมุมอีกด้วย นอกจากนั้นศัตรูบางตัวยังตั้งกลุ่มขึ้นมาเพื่อต่อสู้กับไอ้แมงมุมด้วย เช่น กลุ่มซินนิสเตอร์ซิกซ์ (Sinister Six) เป็นต้น