มาริอา พระมารดาของอีซาแบลได้กล่าวไว้อย่างชัดเจนในพินัยกรรมว่าพระธิดาของพระองค์ต้องสมรสกับกษัตริย์หรือพระโอรสตามกฎหมายของกษัตริย์เท่านั้น และการ์โลส (คาร์ล) แห่งฮาพสบวร์คถูกมองว่าเป็นคู่ครองที่เหมาะสมสำหรับอีซาแบล พระองค์เป็นพระโอรสของฆัวนาแห่งกัสติยา พระเชษฐภคินีของมาริอา กับเฟลิเปผู้หล่อเหลา ดยุคแห่งบูร์กอญ จึงมีศักดิ์เป็นลูกพี่ลูกน้องชั้นที่หนึ่งของอีซาแบล

การสมรสของการ์โลสและอีซาแบลมีความสำคัญอย่างยิ่งต่อทั้งสเปนและโปรตุเกส ด้วยโปรตุเกสเป็นราชอาณาจักรที่มั่งคั่ง ส่วนการ์โลสก็ได้รับเลือกเป็นจักรพรรดิแห่งจักรวรรดิโรมันอันศักดิ์สิทธิ์ การเป็นพันธมิตรกันของสองราชอาณาจักรจะเป็นสายสัมพันธ์ที่แข็งแกร่งที่สุดในยุโรป ทว่ากีโยม เดอ ครัว หนึ่งในที่ปรึกษาของจักรพรรดิการ์โลสกลับแนะนำให้พระองค์สมรสกับแมรี ทิวเดอร์ ลูกพี่ลูกน้องชั้นที่หนึ่งอีกคนของพระองค์ซึ่งเป็นพระธิดาของพระเจ้าเฮนรีที่ 8 แห่งอังกฤษกับกาตาลินาแห่งอารากอน แมรี ทิวเดอร์อ่อนวัยกว่าจักรพรรดิการ์โลส 16 พรรษา ทั้งคู่หมั้นหมายกันในปี ค.ศ. 1521 แต่ต่อมาในปี ค.ศ. 1525 พระองค์ได้ล้มเลิกแผนการสมรสเนื่องจากแมรียังเด็กเกินไป ในขณะที่จักรพรรดิไม่ต้องการรออีกต่อไป

พระองค์หันกลับมาหาอีซาแบลอีกครั้ง พระนางอ่อนวัยกว่าพระองค์เพียง 3 พรรษา และมีสินเดิมติดตัวเป็นเงิน 900,000 กรูซาดูโปรตุเกสซึ่งมากพอที่จะช่วยพัฒนาเศรษฐกิจของจักรวรรดิที่ย่ำแย่หลังการทำสงครามอิตาลีในช่วงปี ค.ศ. 1521–1526 การพูดภาษาสเปนได้อย่างคล่องแคล่วเป็นอีกเหตุผลหนึ่งที่ทำให้จักรพรรดิการ์โลสตัดสินใจสมรสกับพระนาง ขณะเดียวกันกาตาลินาแห่งออสเตรีย พระขนิษฐาของพระองค์ก็ได้สมรสกับพระเจ้าฌูเอาที่ 3 แห่งโปรตุเกส พระเชษฐาของอีซาแบล สองพี่น้องแห่งโปรตุเกส พระเจ้าฌูเอาที่ 3 กับอีซาแบล เป็นลูกพี่ลูกน้องชั้นที่หนึ่งของสองพี่น้องที่ทั้งคู่สมรสด้วย ทั้งสี่คนเป็นพระนัดดาของพระราชินีนาถอิซาเบลที่ 1 แห่งกัสติยากับพระเจ้าเฟร์นันโดที่ 2 แห่งอารากอน ซึ่งการสมรสของทั้งคู่เป็นการรวมสเปนเข้าด้วยกัน

ปี ค.ศ. 1526 อีซาแบลได้เดินทางมาสเปนเพื่อพบกับดยุคแห่งคาลาเบรีย, อัครมุขนายกแห่งโตเลโด และดยุคแห่งเบฆาร์ ก่อนเดินทางต่อไปเซบิยาเพื่อพบกับจักรพรรดิการ์โลสด้วยเหตุผลทางการเมือง พระองค์ไปถึงเซบิยาในเดือนมีนาคม สองอาทิตย์ต่อมาจักรพรรดิการ์โลสได้ตามมาสมทบ พระองค์ตกหลุมรักอีซาแบลทันทีและตัดสินสมรสกับพระนางอย่างรวดเร็ว ทั้งคู่สมรสกันในวันที่ 11 มีนาคม ค.ศ. 1526 ที่พระราชวังอัลกาซาแห่งเซบิยาของชาวมัวร์ การสมรสแม้จะเริ่มต้นด้วยเหตุผลด้านการเงินและด้านราชวงศ์ แต่ต่อมากลับกลายเป็นความสัมพันธ์ที่มากกว่าการสมรสเพื่อผลประโยชน์ ทั้งคู่ใช้เวลาช่วงดื่มน้ำผึ้งพระจันทร์ด้วยกันอย่างหวานชื่นที่อันดาลูซิอาในอาลัมบราในกรานาดา ทรงอยู่ในโลกที่มีเพียงพระองค์สองคนและพูดคุยหัวเราะกันตลอดเวลา

ในตอนที่สมรสอีซาแบลได้รับการบรรยายไว้ว่าทรงบอบบางและน่าทะนุถนอม ทั้งพระองค์และพระสวามีต่างศรัทธาในศาสนาอย่างแรงกล้า