อีซาแบลเสด็จพระราชสมภพที่ลิสบอน ราชอาณาจักรโปรตุเกส เมื่อวันที่ 24 ตุลาคม ค.ศ. 1503 ทรงเป็นพระโอรสธิดาคนที่สองและเป็นพระธิดาคนโตของพระเจ้ามานูแวลที่ 1 แห่งโปรตุเกสกับมาริอาแห่งอารากอน พระมเหสีคนที่สองซึ่งเป็นพระธิดาของสมเด็จพระราชินีนาถอิซาเบลที่ 1 แห่งกัสติยา พระองค์ทรงได้รับการตั้งชื่อว่าอีซาแบลตามพระนางและพระธิดาคนแรกของพระนางซึ่งเป็นพระมเหสีคนแรกของพระบิดา (อิซาเบลแห่งอารากอน) ในปีที่อีซาแบลเกิด สมเด็จพระราชินีนาถอิซาเบลที่ 1 พระอัยกีมีสุขภาพที่ย่ำแย่และสิ้นพระชนม์ในปีต่อมา

อีซาแบลมีชีวิตวัยเยาว์อันแสนสุขในครอบครัวที่มั่งคั่ง ทรงใช้ช่วงเวลาวัยเยาว์ที่พระราชวังรีไบราซึ่งต่อมาถูกแผ่นดินไหวทำลาย พระองค์โปรดการเรียนรู้ภาษาใหม่ ๆ และโปรดปรานในงานวรรณกรรม ในวัยเด็กทรงศึกษาภาษาละติน ภาษาสเปน และภาษาฝรั่งเศส