อีซาแบลมีพระโอรสธิดาให้จักรพรรดิการ์โลสหกคน คือ

1. พระเจ้าเฟลิเปที่ 2 แห่งสเปน (ประสูติ ค.ศ. 1527)
2. มาริอา (ประสูติ ค.ศ. 1528) สมรสกับจักรพรรดิมักซีมีเลียนที่ 2 แห่งจักรวรรดิโรมันอันศักดิ์สิทธิ์ ลูกพี่ลูกน้องชั้นที่หนึ่งของพระองค์เอง
3. เฟร์นันโด (ประสูติ ค.ศ. 1529) สิ้นพระชนม์ในวัยทารก
4. ฆัวนาแห่งออสเตรีย (ประสูติ ค.ศ. 1535) สมรสกับอิงฟังตึฌูเอา มานูแวลแห่งโปรตุเกส ลูกพี่ลูกน้องชั้นที่หนึ่งทั้งในฝั่งบิดาและมารดา ทรงเป็นมารดาของพระเจ้าซือบัสตีเอาแห่งโปรตุเกส
5. ฆวน (ประสูติ ค.ศ. 1537) สิ้นพระชนม์ในวัยทารก
6. พระโอรส (ประสูติ ค.ศ. 1539) สิ้นพระชนม์ในครรภ์

พระองค์ทำหน้าที่เป็นผู้สำเร็จราชการแผ่นดินแทนพระสวามีสองครั้ง คือ ในช่วงปี ค.ศ. 1529–1532 และในช่วงปี ค.ศ. 1535–1539 ทรงแก้ไขปัญหาต่าง ๆ ของราชอาณาจักรได้อย่างง่ายดายและงดงามด้วยพระปรีชาสามารถ พระองค์เดินทางไปทั่วจักรวรรดิและมักใช้เวลาช่วงหน้าร้อนที่อาบิลา

ในช่วงที่อยู่ห่างกันทั้งคู่พูดคุยกันผ่านทางจดหมาย อีซาแบลเขียนจดหมายถึงพระสวามีเพื่อเล่าข่าวคราวความเป็นไปภายในจักรวรรดิและถามไถ่สารทุกข์สุขดิบของพระองค์ จักรพรรดิการ์โลสมักเขียนตอบกลับมา แต่มีบางครั้งที่พระองค์ไม่สามารถตอบกลับมาได้ทำให้อีซาแบลต้องสืบข่าวคราวของพระองค์ด้วยตนเอง พระนางถึงขั้นเคยต่อว่าพระองค์ที่ไม่ยอมส่งข่าวมาว่าอยู่ที่ไหนและได้แจ้งแก่พระสวามีว่าพระนางจะเขียนจดหมายหาพระองค์ทุก 20 วัน เมื่อจักรพรรดิกลับมายังจักรวรรดิ พระนางได้จัดงานเลี้ยงต้อนรับพระองค์อย่างยิ่งใหญ่

แม้จะต้อนรับพระสวามีอย่างหรูหรา แต่อีซาแบลกลับใช้ชีวิตอย่างเรียบง่าย ทรงเป็นที่รักยิ่งของพระสวามี นอกจากจะเป็นพระมเหสีที่ยอดเยี่ยม พระองค์ยังเป็นพระมารดาที่เลี้ยงดูพระโอรสธิดาด้วยความรักและใส่ใจในการศึกษาของลูก ๆ

วันที่ 21 เมษายน ค.ศ. 1539 อีซาแบลได้ให้กำเนิดพระโอรสที่สิ้นพระชนม์ในครรภ์ ต่อมาทรงมีไข้สูงและตกเลือด สองอาทิตย์หลังการคลอดพระองค์ได้สิ้นพระชนม์ในวันที่ 1 พฤษภาคม ค.ศ. 1539 ด้วยวัย 35 พรรษา การสิ้นพระชนม์ของพระองค์ส่งผลอย่างมากต่อจักรพรรดิการ์โลส พระองค์ไม่ยอมสมรสใหม่และครองตัวเป็นโสดตลอดชีวิตที่เหลือ ในปี ค.ศ. 1547 พระองค์ได้รับเป็นบิดาของบุตรนอกสมรสสองคน ซึ่งคนแรกเกิดก่อนที่พระองค์จะอภิเษกสมรสกับอีซาแบล

จักรพรรดิแต่งดำตลอดชีวิตที่เหลือเพื่อไว้อาลัยให้กับการจากไปของพระมเหสี พระองค์เสียใจอย่างมากจนไม่สามารถเข้าร่วมพิธีฝังศพของพระนางได้ เฟลิเป พระโอรสของทั้งคู่ได้ฝังร่างของพระนางไว้ที่โบสถ์น้อยในกรานาดา ขณะที่จักรพรรดิได้ขังตัวอยู่ในอารามเป็นเวลาสองเดือนเพื่อไว้อาลัยและทำใจกับการสูญเสียพระมเหสี ปี ค.ศ. 1540 พระองค์ได้ว่าจ้างตอมา เครกียง ให้ประพันธ์เพลงให้แก่พระมเหสีผู้ล่วงลับ ในปี ค.ศ. 1543 พระองค์ได้ว่าจ้างจิตรกรชื่อทิเชียนให้วาดภาพของพระองค์ ทิเชียนได้วาดภาพของอีซาแบลหลายภาพ รวมถึงภาพ "พระบรมสาทิสลักษณ์ของจักรพรรดินีอีซาแบลแห่งโปรตุเกส" และภาพ "ลาโกลเรีย" จักรพรรดิการ์โลสได้เก็บภาพวาดไว้กับตัวแม้ในยามที่ทรงเกษียณตัวเข้าสู่อารามยุสเต

อีซาแบลเป็นที่รู้จักในชื่อ "จักรพรรดินีคาร์เนชัน" ด้วยจักรพรรดิการ์โลสได้นำดอกคาร์เนชันสีแดงเข้ามาปลูกในจักรวรรดิเพื่อเป็นตัวแทนของความรักที่พระองค์มีต่อพระนาง ต่อมาดอกไม้ชนิดนี้ได้กลายเป็นดอกไม้ประจำชาติของสเปน

จักรพรรดิการ์โลสสิ้นพระชนม์ในปี ค.ศ. 1574 ร่างของพระองค์กับอีซาแบลถูกฝังเคียงข้างกันที่อารามหลวงซานโลเรนโซเดเอลเอสโกเรียลตามพระราชประสงค์ของจักรพรรดิการ์โลส ในปี ค.ศ. 1654 พระเจ้าเฟลิเปที่ 4 พระปนัดดาได้ย้ายร่างของทั้งคู่ไปฝังที่สุสานบรรพชนกษัตริย์