การวินิจฉัยโรคพิษสุนัขบ้าอาจทำได้ยาก เนื่องจากผู้ป่วยระยะแรกจะอาการคล้ายคลึงกับโรคอื่น ๆ หรือเหมือนการมีบุคลิกก้าวร้าวโดยทั่วไป[19] วิธีที่ให้ผลแม่นยำสามารถอ้างอิงได้ในการวินิจฉัยโรคนี้ต้องทำโดยการตรวจหาแอนติบอดีด้วยสารเรืองแสง (FAT) ซึ่งเป็นวิธีที่แนะนำโดยองค์การอนามัยโลก[20] วิธีนี้อาศัยโมเลกุลตรวจจับที่เรืองแสงได้ (นิยมใช้เป็นฟลูออเรสซีนไอโซไทโอไซยาเนต) ที่จับกับแอนติบอดีที่จำเพาะต่อเชื้อพิษสุนัขบ้า ทำให้สามารถจับกับแอนติเจนของเชื้อ และสามารถตรวจพบได้ด้วยวิธีการทำให้เรืองแสงและตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์ (fluorescent microscopy technique) วิธีตรวจหาแอนติเจนของเชื้อด้วยการย้อมสิ่งส่งตรวจโดยตรงด้วยสารเรืองแสงนี้เป็นวิธีเดียวที่สามารถตรวจหาเชื้อได้โดยตรง ที่รวดเร็วและประหยัดที่สุด โดยไม่จำเป็นต้องอาศัยอาการหรือแหล่งที่มาของผู้ป่วยหรือสัตว์ที่ป่วย อย่างไรก็ดีสิ่งส่งตรวจที่เน่าเสียอาจทำให้ผลการตรวจด้วยวิธีนี้ไม่แม่นยำได้[21] การตรวจด้วยวิธี RTPCR เป็นวิธีตรวจวินิจฉัยอีกวิธีหนึ่งที่มีความไวและความจำเพาะสูง และสะดวกมากพอที่จะสามารถใช้เป็นวิธีพื้นฐานได้ในห้องปฏิบัติการที่มีศักยภาพเพียงพอ[22] โดยเฉพาะในการตรวจสิ่งส่งตรวจที่เน่าเสียแล้ว[23]หรือเก็บไว้นาน[24] นอกจากนี้ยังสามารถตรวจวินิจฉัยได้อย่างแม่นยำจากการตรวจชิ้นเนื้อของสมองจากร่างที่เสียชีวิตแล้ว หรืออาจใช้น้ำลาย ปัสสาวะ หรือน้ำหล่อสมองไขสันหลังของร่างที่เสียชีวิตแล้ว ก็ได้เช่นกัน แต่ผลจะไม่แม่นยำเท่าใช้ชิ้นเนื้อสมอง[21] การตรวจพบอินคลูชันบอดีที่เรียกว่าเนกริบอดีในเซลล์สมองถือเป็นการวินิจฉัยโรคพิษสุนัขบ้าได้ 100% แต่พบในผู้ป่วยหรือสัตว์ป่วยเพียง 80% เท่านั้น[25] กรณีมีผู้ป่วยถูกสัตว์กัด หากเป็นไปได้ควรตามสัตว์ที่กัดนั้นมาตรวจหาเชื้อ[26]