ในช่วงสมาพันธรัฐเยอรมัน ปรัสเซียเกิดความขัดแย้งกับออสเตรียเรื่องการยึดครองดัชชีรัฐชเลสวิช-ฮ็อลชไตน์ (Schleswig-Holstein) ดินแดนทางตอนเหนือของเยอรมนีติดกับเดนมาร์ก ซึ่งทั้งสองฝ่ายต่างมีความต้องการดินแดนนั้นมาก ต่อมาได้มีการประชุมกันหารือที่เมืองแฟรงก์เพิร์ตอัมไมน์ ผลก็คือฝ่ายปรัสเซียเป็นฝ่ายผิด เป็นเพราะเอกอัครทูตรัฐต่าง ๆ ในสมาพันธรัฐเยอรมันส่วนใหญ่ต่างเข้าข้างออสเตรียหมดและไม่ต้องการให้ปรัสเซียครอบงำในสมาพันธรัฐเยอรมัน สร้างความไม่พอใจอย่างมากสำหรับปรัสเซียจึงได้ประกาศสงครามกับออสเตรียและแยกตัวออกจากสมาพันธรัฐเยอรมันทันที

กองทัพปรัสเซียและออสเตรียได้ปะทะกันที่เมืองโคนิกซ์เกรซ์ (Battle of Königgrätz) แคว้นโบฮีเมียของออสเตรีย กองทัพปรัสเซียได้ใช้กลยุทธ์เดินขบวนแยกกันและโจมตีพร้อมกันทำให้กองทัพออสเตรียและพันธมิตรถูกปิดล้อมและได้พยายามจะตีฝ่าออกไปแต่ไม่สำเร็จ เพราะฝ่ายปรัสเซียมีอาวุธปืนที่ทันสมัยนั้นก็คือ ปืนนีดเดิล (Needle Gun) ซึ่งเป็นปืนที่บรรจุได้นัดเดียวและกระสุนนั้นเป็นปลอกกระดาษ โดยในปลอกกระดาษนั้นจะมีลูกปืนอยู่ที่หัวดินปืนอยู่ตรงกลางและแก็ปอยู่ตรงท้ายเพื่อให้เข็มแทงฉนวนแทงไปที่แก็ปทำให้เกิดระเบิดและลูกกระสุนก็จะถูกยิงออกไป นอกจากนั้นสามารถบรรจุกระสุนได้อย่างรวดเร็ว ต่างจากออสเตรียซึ่งยังใช้ปืนแบบตักดินปืนลงปากกระบอกเพื่อบรรจุกระสุนซึ่งทำให้เสียเวลามากในการยิง ด้วยความได้เปรียบของปรัสเซียนี่เองทำให้ออสเตรียพ่ายแพ้อย่างยับเยินและเสียหทหารไปอย่างมาก ออสเตรียได้ส่งทูตเจรจากับปรัสเซียเพื่อเจรจาสงบศึกทันทีโดยสัญญาว่าจะไม่ก้าวก่ายในสมาพันธรัฐเยอรมันอีก และจะนับถือกันเป็นเมืองพี่เมืองน้อง แต่มีเงื่อนไขเดียวคือไม่ยอมเสียดินแดนอย่างเด็ดขาด ออทโท ฟอน บิสมาร์คเห็นด้วยกับช้อเสนอนี้แต่พระเจ้าวิลเฮล์มที่ 1 กลับไม่เห็นด้วยและต้องการแผ่นดินบางส่วนของออสเตรีย บิสมาร์คได้พยายามเกลี้ยกล่อมจักรพรรดิวิลเฮล์มที่ 1 อย่างหนักและยืนกรานว่า หากไม่ยอมรับข้อเสนอของออสเตรีย จะขอลาออกจากตำแหน่งทันที เวลาต่อมาในที่สุดพระเจ้าวิลเฮล์มที่ 1 ทรงยอมรับข้อเสนอของออสเตรีย ผลก็คือ ออสเตรียไม่เสียดินแดนและเริ่มฟื้นฟูความสัมพันธ์ที่ดีกับปรัสเซียในที่สุด

หลังจากนั้นปรัสเซียได้ผนวกราชอาณาจักรฮันโนเฟอร์และรัฐอื่น ๆ จัดตั้งเป็นสมาพันธรัฐเยอรมันเหนือและมีความคิดที่จะรวมภาคใต้มาเข้าด้วยกัน แต่ทว่าทางจักรวรรดิฝรั่งเศสที่ 2ได้เข้ามาแทรกแซงยับยั้งทำให้สมาพันธรัฐเยอรมันใต้ยังคงเป็นอิสระอยู่ ต่อมาทางเสปนได้อัญเชิญเจ้าชายเลโอโปลด์แห่งโฮเฮนโซลเลิร์น-ซิกมาริงเง็น ผู้มีเชื้อสายปรัสเซียขึ้นครองราชย์ในเสปน เจ้าชายเกิดความรู้สึกลังเลอยู่พักแต่ก็ตอบรับในที่สุด แต่กลับไม่เป็นไปตามนั้น ทางฝรั่งเศสไม่ต้องการให้เจ้าชายเลโอโปลด์ให้ขึ้นครองราชย์ในเสปนเพราะเกรงอำนาจในปรัสเซียจึงได้บีบบังคับให้เจ้าชายเลโอโปลด์สละสิทธิ์เสีย เจ้าชายเลโอโปลด์ก็ต้องยอมสละสิทธิ์ทันที