ขอบเขตการออกฤทธิ์ของนีโอมัยซินนั้นมีความคล้าบคลึงกันกับยาปฏิชีวนะในกลุ่มอะมิโนไกลโคไซด์ ซึ่งออกฤทธิ์ต้านเชื้อแบคทีเรียแกรมลบได้เป็นอย่างดีอื่นๆ นอกจากนี้ยังสามารถออกฤทธิ์ต่อแบคทีเรียแกรมบวกได้บางสายพันธุ์ ยานี้มีความสัมพันธ์กับการเกิดอาการพิษในมนุษย์ โดยมีรายงานการเกิดปฏิกิริยาการแพ้ยาอยู่บ่อยครั้ง[16] ในบางครั้งแพทย์จึงไม่ใช้ยาปฏิชีวนะรูปแบบครีมที่มีส่วนผสมของนีโอมัยซิน เช่น พอลีสปอรีน ซึ่งเป็นสูตรผสมระหว่างบาซิตราซิน และพอลีมัยซินบี และ/หรือเจนตามัยซิน หรือกรามิซิดีน[17] เชื้อแบคทีเรียแกรมลบสำคัญทางการแพทย์ที่ตอบสนองต่อการรักษาด้วยนีโอมัยซินได้ดี ได้แก่ Enterobacter cloacae, Escherichia coli และ Proteus vulgaris ซึ่งมีค่าความเข้มข้นของยาในระดับต่ำสุด (ในหลอดทดลอง) ที่สามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของเชื้อแบคทีเรียได้ (Minimum Inhibitory Concentration; MIC) เท่ากับ >16 μg/ml, 1 μg/ml, และ 0.25 μg/ml ตามลำดับ[18]