นีโอมัยซินถูกค้นพบในปี ค.ศ. 1949 โดยนักชีวเคมีและนักจุลชีววิทยาชาวอเมริกันเชื้อสายยิวชื่อ เซลมัน แวกส์มัน และ ฮิวเบิร์ต เลเชอวาลิเออร์ (Hubert Lechevalier) ในห้องปฏิบัติการของมหาวิทยาลัยรัทเกอร์ (Rutgers University) ทั้งนี้ นีโอมัยซินนั้นถูกสร้างขึ้นได้ตามธรรมชาติโดยเชื้อแบคทีเรีย Streptomyces fradiae.[22] โดยกระบวนการการสังเคราะห์จำเป็นอาศัยอาหารเพาะเลี้ยงเชื้อที่จำเพาะและในอยู่สภาวะไร้ออกซิเจน[23]