นีโฮมัยซินถูกแยกจากเชื้อแบคทีเรีย Streptomyces fradiae และ Streptomyces albogriseus ได้เป็นครั้งแรกในปี ค.ศ. 1949 (NBRC 12773)[6] โดยเป็นยาที่เป็นส่วนผสมของนีโอมัยซินบี (neomycin B หรือ framycetin) และอิพิเมอร์ (Epimers) ของมัน คือ นีโอมัยซินซี ซึ่งมีอยู่ประมาณร้อยละ 5 – 15 ของมวลทั้งหมด โดยทั้งสองสารเป็นสารสำคัญในสารผสมนีโอมัยซินที่ออกฤทธิ์ได้ดีในสภาวะที่เป็นด่าง[7] นีโอมัยซินละลายน้ำได้ดีแต่ไม่ละลายในตัวทำละลายอินทรีย์[8] ทั้งนี้ นีโอมัยซินออกฤทธิ์ต้านเชื้อแบคทีเรียได้ทั้งแกรมบวกและแกรมลบ แต่ด้วยการเกิดพิษต่อระบบการได้ยินที่เกิดได้ในอัตราที่สูงมาก จึงทำให้มีการจำกัดการใช้ยานี้ในรูปแบบยาใช้ภายนอกและยาที่ใช้สำหรับฆ่าเชื้อแบคทีเรียในช่องปากและทางเดินอาหารเท่านั้น[9]

นีโอมัยซินบี (Neomycin B) มีโครงสร้างที่ประกอบด้วย 4 ส่วนเชื่อมต่อกันด้วยพันธะไกลโคไซด์ (glycosidic bond) ได้แก่ D-neosamine, 2-deoxystreptamine (2-DOS), D-ribose, และ L-neosamine.

นีโอมัยซินเอ หรือเรียกอีกชื่อหนึ่งว่า นีเอมีน (neamine) ซึ่งมีส่วนประกอบของวง D-neosamine และ 2-deoxystreptamine ถูกสร้างจากยีนจำนวน 6 ยีน คือ ยีน DOIS (btrC, neo7) ; ยีน L-glutamine:DOI aminotransferase (btrS, neo6) ; ยีน putative glycosyltransferase (btrM, neo8) ; ยีน putative aminotransferase (btrB, neo18) ซึ่งควบคุมการสร้างเอนไซม์ glutamate-1-semialdehyde 2,1- aminomutase ด้วย; ยีน putative alcohol dehydrogenase (btrE, neo5) ; และยีน putative dehydrogenase อื่นๆ (btrQ, neo11) ซึ่งทำหน้าที่ควบคุมการสร้างเอนไซม์ Choline dehydrogenase และฟลาโวโปรตีนที่เกี่ยวข้องด้วย[10] ส่วนเอนไซม์ที่ทำหน้าที่ในควบคุมการเกิดปฏิกิริยาดีแอซิติลเลชัน (deacetylation) เพื่อนำหมู่อะซิติลออกจาก N-acetylglucosamine ของยากลุ่มอะมิโนไกลโคไซด์ นั้น (Neo16) ยังไม่ทราบแน่ชัด (ลำดับพันธุกรรมคล้ายคลึงกับ BtrD)[11]

ส่วนการเข้าจับของน้ำตาล D-ribose ระหว่างการเกิดปฏิกิริยาไรโบซิเลชัน (ribosylation) ของนีเอมีนนั้น จะใช้ 5-phosphoribosyl-1-diphosphate (PRPP) เป็นตัวให้หมู่ไรโบซิล (BtrL, BtrP) ;[12] ซึ่งควบคุมกระบวนการนี้โดยยีน glycosyltransferase (potential homologues RibF, LivF, Parf) (Neo15)[13]

นีโอซามีนบี (Neosamine B หรือ L-neosamine B) ซึ่งมีโครงสร้างที่คล้ายคลึงกับนีโอซามีนซี (neosamine C หรือ D-niosamine) เป็นอย่างมาก แต่กระบวนการสังเคราะห์นั้นจำเป็นที่จะต้องมีปฏิกิริยาการเกิดอิพิเมอร์ (epimerization) เพิ่มขึ้นมาอีก 1 ขั้นตอน เพื่อสร้างนีโอซามีนบีที่เป็นอิพิเมอร์กับนีโอมัยซินบี[14]

นีโอมัยซินซีสามารถสังเคราะห์ได้จากการผลิตไรบอสตามัยซิน[15]