ในปี ค.ศ. 2005 – 2006 นีโอมัยซินเป็นยาลำดับที่ 5 ที่ก่อให้เกิดปฏิกิริยาการแพ้ได้มากที่สุดในการทำแพ็ทเทสต์ (ร้อยละ 10.0)[21] อาการไม่พึงประสงค์อื่นของนีโอมัยซินอาจเกิดขึ้นได้นั้นไม่แตกต่างไปจากยายาปฏิชีวนะชนิดอื่นที่อยู่ในกลุ่มอะมิโนไกลโคไซด์ โดยนีโอมัยซินสามารถก่อให้เกิดพิษต่อระบบการได้ยิน (ototoxicity) ทำให้เกิดเสียงดังในหูที่ผิดปกติ (tinnitus), สูญเสียการได้ยิน, และเกิดความผิดปกติของ Vestibular system แต่อาการไม่พึงประสงค์ดังข้างต้นที่กล่าวมานั้นเกิดได้ค่อนข้างน้อย ผู้ป่วยที่มีเสียงดังในหูผิดปกติ หรือมีภาวะประสาทหูเสื่อม (sensorineural hearing loss) อยู่ก่อนแล้ว ควรแจ้งแพทย์ให้ทราบก่อนการใช้ยานี้