การดื้อต่อยานีโอมัยซินของแบคทีเรียนั้นจะเกิดผ่านยีนที่ควบคุมการสร้างเอนไซม์อะมิโนไกลโคไซด์ฟอสโฟทรานส์เฟอเรส  (aminoglycoside phosphotransferase หรือ Kanamycin kinase)  จำนวน 1 – 2 ยีน[3] ในปัจจุบัน ยีนที่มีชื่อว่า neo ซึ่งส่วนใหญ่จะถูกใส่เข้าไปอยู่ในพลาสมิด (Plasmid) ซึ่งเป็นสารพันธุกรรมที่อยู่นอกโครโมโซม (extrachromosomal DNA) มักถูกใช้โดยนักอณูชีววิทยาเพื่อเพาะเลี้ยงเซลล์สายพันธุ์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมที่คงทนต่อยาปฏิชีวนะเพื่อจุดประสงค์ในการทดลองสร้างสารโปรตีนบางชนิด พลาสมิดที่ถูกผลิตขึ้นเพื่อสร้างโปรตีนเชิงการค้าในปัจจุบันมีหลายชนิดที่มียีน neo เป็นยีนบ่งชี้ (selectable marker) โดยเซลล์ที่ไม่มีส่วนประกอบของยีนนี้ (Non-transfected cells) จะตายในการเพาะเลี้ยงเมื่อสัมผัสกับนีโอมัยซินหรือยาปฏิชีวนะอื่นที่เทียบเคียงกันได้ โดยนีโอมัยซินหรือกานามัยซินจะถูกใช้ในการเพาะเลี้ยงเซลล์กลุ่มโพรแคริโอต ส่วนเซลล์ยูแคริโอตนั้นจะใช้จีนีติซิน (G418)

นีโอมัยซินออกฤทธิ์โดยจับกับหน่วยย่อย 30 เอสของไรโบโซม ซึ่งจะส่งผลยับยั้งการแปรรหัสของเอ็มอาร์เอ็นเอ[4] นอกจากนี้นีโอมัยซินยังมีความจำเพาะในการจับกับ phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) สูงมาก ซึ่งสารฟอสโฟลิพิดดังกล่าวเป็นส่วนประกอบที่สำคัญของเยื่อหุ้มเซลล์[5]