การกระทำอันเป็นที่ถกเถียงที่สุดในรัชสมัยของพระเจ้ามานูแวลคือการบังคับให้ชาวยิวทุกคนที่อาศัยอยู่ในโปรตุเกสเปลี่ยนศาสนา เนื่องจากเมื่อครั้งที่ทำการตกลงสัญญาสมรสครั้งแรกกับเจ้าหญิงอิซาเบล เจ้าหญิงแห่งกัสติยาและอารากอนได้ตั้งเงื่อนไขว่าจะยอมเดินทางมาสมรสกับพระเจ้ามานูแวลก็ต่อเมื่อโปรตุเกสกำจัดชาวมุสลิมและชาวยิวทุกคนออกจากประเทศ (ก่อนหน้านี้ในปี ค.ศ. 1492 พระเจ้าฌูเวาที่ 2 ได้เปิดรับชาวยิวหลายพันคนที่ถูกขับไล่ออกมาจากสเปน) ในช่วงต้นเดือนธันวาคม ค.ศ. 1496 พระเจ้ามานูแวลได้ออกกฤษฎีกาให้ชาวยิวและชาวมุสลิมทุกคนออกไปจากประเทศ โดยให้เวลา 10 เดือน คือ ตั้งแต่เดือนมกราคมจนถึงเดือนตุลาคมของ ค.ศ. 1497 ไม่เช่นนั้นจะมีโทษประหารชีวิต พระองค์ยังประกาศให้รางวัลแก่ผู้แจ้งเบาะแสของชาวยิวและมุสลิมเป็นทรัพย์สินที่ดินของชาวยิวและชาวมุสลิมคนนั้นๆ ทั้งนี้ชาวยิวและชาวมุสลิมที่เปลี่ยนมานับถือศาสนาคริสต์จะได้รับอนุญาตให้อยู่ในโปรตุเกสต่อไป ทว่ามีชาวยิวเพียงไม่กี่คนที่ได้เดินทางออกไปจากประเทศ เนื่องจากพระเจ้ามานูแวลได้ใช้อำนาจทั้งหมดที่มีขัดขวางไม่ให้ชาวยิวเดินทางออกไป ชาวยิวกว่า 20,000 คนที่พยายามเดินทางออกจากประเทศที่ท่าเรือลิสบอนถูกบังคับให้เข้ารับการทำพิธีศีลล้างบาป ขณะที่ชาวมุสลิมได้โอกาสในการเดินทางออกจากประเทศมากกว่า เนื่องจากกษัตริย์ไม่อยากมีปัญหากับผู้ปกครองของประเทศปลายทางที่อาจส่งกำลังทหารมาแก้แค้นหากพระองค์กระทำกับชาวมุสลิมเช่นเดียวกับชาวยิว

ในเดือนเมษายน ค.ศ. 1497 พระองค์มีคำสั่งให้นำตัวเด็กอายุต่ำกว่า 14 ปีที่เกิดจากพ่อแม่ชาวยิวที่ไม่ยอมเปลี่ยนศาสนามาจากพ่อแม่เพื่อส่งไปให้ชาวคริสต์เลี้ยงดูและสอนศาสนาคริสต์ ต่อมาทรงขยายช่วงอายุเพิ่มเป็น 20 ปี กระบวนการบังคับให้เปลี่ยนศาสนาเสร็จสิ้นในช่วงปลายปี ค.ศ. 1497 และก่อให้เกิดโศกนาฏกรรมเมื่อพ่อแม่หลายคนยินดีที่จะสังหารบุตรชายของตนดีกว่ายอมให้ถูกส่งไปศึกษาคำสอนของศาสนาคริสต์

การบังคับเปลี่ยนศาสนาทำให้เกิดกลุ่ม "ชาวคริสต์ใหม่" ขึ้นในโปรตุเกส โดยคนกลุ่มนี้มีสถานะทางสังคมที่ไม่มั่นคงเนื่องจากถูกมองว่ามีสายเลือดยิว ทำให้ถูกกีดกันไม่ให้เข้ารับราชการและไม่ได้รับอนุญาตให้สมรสกับขุนนางหรือชาวคริสต์เดิม ทั้งยังถูกรังความและถูกลักขโมยทรัพย์สิน ในปี ค.ศ. 1506 ชาวคริสต์ใหม่ถูกไล่ล่าอย่างหนัก เพราะประชาชนกล่าวหาว่าสาเหตุที่กาฬโรคระบาดในกรุงลิสบอนเนื่องจากมีคนกลุ่มนี้ซึ่งไม่ได้ศรัทธาในพระเจ้าอย่างแท้จริงอาศัยอยู่ในเมือง บ้านและวัดของชาวคริสต์ใหม่ถูกเผา ชาวคริสต์ใหม่ถูกสังหารไปกว่า 3,500 คน ผู้มีอำนาจสามารถควบคุมสถานการณ์ได้สามวันต่อมา ผู้กระทำผิดฐานสังหารหมู่ถูกตัดสินประหารชีวิต