หลังพระนางมารีอาสวรรคต พระเจ้ามานูแวลที่ 1 ประสงค์จะสมรสกับเจ้าหญิงเลโอนอร์ พระราชธิดาของพระราชินีนาถฆัวนาแห่งกัสติยา (หรือเจ้าหญิงฆัวนาที่ขึ้นสืบทอดตำแหน่งต่อจากพระราชมารดา) กับพระเจ้าเฟลิเปที่ 1 แห่งกัสติยา (หรือฟิลิปแห่งฮาพส์บวร์ค) เพื่อสานต่อนโยบายการสมรสเพื่อสร้างราชวงศ์ใหม่ที่จะรวมราชอาณาจักรทั้งหมดในคาบสมุทรไอบีเรียเป็นหนึ่งเดียว ราชวงศ์ฮาพส์บวร์คจึงตกลงทำสัญญาสมรสระหว่างเจ้าหญิงเลโอนอร์กับพระเจ้ามานูแวล

พิธีอภิเษกสมรสถูกจัดขึ้นในกรุงลิสบอนเมื่อวันที่ 7 มีนาคม ค.ศ. 1519 โดยกษัตริย์แห่งโปรตุเกสมีพระชนมายุอยู่ในช่วงห้าสิบพรรษา ส่วนเจ้าหญิงแห่งกัสติยามีพระชนมายุ 21 พรรษา ทั้งคู่มีพระราชบุตรด้วยกันสองคน คือ

• การ์โลส (ประสูติ ค.ศ. 1520) สิ้นพระชนม์หลังประสูติได้ไม่นาน
• มารีอา (ประสูติ ค.ศ. 1521)

สองปีหลังการสมรสพระเจ้ามานูแวลที่ 1 สวรรคตด้วยกาฬโรคในกรุงลิสบอนเมื่อวันที่ 13 ธันวาคม ค.ศ. 1521