บทความหลัก: เทคนิคทางพันธุวิศวกรรม

ขั้นตอนแรกคือการเลือกและแยกยีนที่จะแทรกเข้าไปในสิ่งมีชีวิตดัดแปลงพันธุกรรม. ณ ปี 2012, ในพืชจีเอ็มเชิงพาณิชย์ส่วนใหญ่มียีนที่โอนเข้ามาในตัวมันที่ให้การป้องกันแมลงหรือทนทานต่อสารเคมีกำจัดวัชพืช[50]. ยีนสามารถแยกได้โดยการใช้เอนไซม์ข้อจำกัด (อังกฤษ: restriction enzymes) เพื่อตัดดีเอ็นเอให้เป็นเศษๆและใช้วิธี gel electrophoresis เพื่อแยกพวกมันออกตามความยาว[51]. ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลิเมอร์ (PCR) ยังสามารถเพื่อขยายขึ้นส่วนของยีน, ซึ่งจากนั้นจะสามารถแยกได้ผ่านวิธีการ gel electrophoresis[52]. ถ้ายีนที่ถูกเลือกหรือจีโนมของสิ่งมีชีวิตผู้บริจาคได้มีการศึกษามาดี, มันก็อาจจะปรากฏในห้องสมุดทางพันธุกรรม. ถ้ารู้ลำดับดีเอ็นเอ, แต่ไม่มีสำเนาของยีน, มันก็สามารถถูกสังเคราะห์แบบเทียมได้[53].

ยีนที่จะแทรกเข้าไปในสิ่งมีชีวิตดัดแปลงพันธุกรรมจะต้องรวมเข้ากับองค์ประกอบทางพันธุกรรมอื่นๆเพื่อให้มันทำงานอย่างถูกต้อง. ยีนยังสามารถได้รับการดัดแปลงในขั้นตอนนี้เพื่อให้มันการแสดงออกหรือมีประสิทธิภาพที่ดีกว่าอีกด้วย. เช่นเดียวกับยีนที่จะแทรกเข้าไป, โครงสร้างดีเอ็นเอส่วนใหญ่จะประกอบด้วยผู้ก่อการ(ทางชีวภาพ) (อังกฤษ: (biology) promoter) และภูมิภาคที่เป็นตัวปิดท้ายทางพันธุกรรม (อังกฤษ: (genetics) terminator region) เช่นเดียวกับยีนเครื่องหมายที่เลือกได้ (อังกฤษ: selectable marker gene). ภูมิภาคผู้ก่อการจะเริ่มต้นการถอดรหัสของยีนและสามารถนำมาใช้ในการควบคุมสถานที่และระดับของการแสดงออกของยีน, ในขณะที่ภูมิภาคตัวปิดท้ายสิ้นสุดการถอดความ. เครื่องหมายที่เลือกได้, ซึ่งในกรณีส่วนใหญ่ประศาสน์ความต้านทานยาปฏิชีวนะให้กับสิ่งมีชีวิตที่มันแสดงออก, จำเป็นที่จะต้องตรวจสอบว่าเซลล์ตวไหนจะถูกแปลงกับยีนใหม่. โครงสร้างจะถูกทขึ้นำโดยใช้เทคนิคดีเอ็นเอ recombinant, เช่นข้อจำกัดน้ำย่อย (อังกฤษ: restriction digest), การผูก (อังกฤษ: ligations) และการโคลนโมเลกุล[54]. การยักย้ายถ่ายเทของดีเอ็นเอมักเกิดขึ้นภายในพลาสมิด.

รูปแบบที่พบมากที่สุดของพันธุวิศวกรรมเกี่ยวข้องกับการแทรกสารพันธุกรรมใหม่แบบสุ่มภายในจีโนมเจ้าภาพ[ต้องการอ้างอิง]. เทคนิคอื่นๆจะยอมให้สารพันธุกรรมใหม่ที่จะถูกแทรกในสถานที่เฉพาะในจีโนมเจ้าภาพหรือสร้างการกลายพันธุ์ที่ loci จีโนมที่สามารถเคาะยีนที่เกิดขึ้นภายในสิ่งมีชีวิต (อังกฤษ: endogenous genes) ออก. เทคนิคของ gene targeting จะใช้ homologous recombination เพื่อกำหนดเป้าหมายที่ต้องการที่จะเปลี่ยนแปลง endogenous genes ที่เฉพาะเจาะจง. สิ่งนี้มีแนวโน้มที่จะเกิดขึ้นที่ความถี่ที่ค่อนข้างต่ำในพืชและสัตว์และโดยทั่วไปต้องใช้ selectable markers. ความถี่ของ gene targeting สามารถเพิ่มขึ้นอย่างมากด้วยการใช้ nucleases ดัดแปลงเช่น zinc finger nucleases[55][56], homing endonucleases ที่ถูกดัดแปลง[57][58], หรือ nucleases ที่สร้างจาก TAL effectors[59][60]. นอกจากการเสริมสร้าง gene targeting, nucleases ที่ถูกดัดแปลงยังสามารถถูกใช้ในการแนะนำการกลายพันธุ์ใน endogenous genes ที่สร้าง gene knockout[61][62].

การแปลง

บทความหลัก: การแปลง (พันธุศาสตร์)

ประมาณ 10% เท่านั้นของแบคทีเรียที่โดยธรรมชาติมีความสามารถดูดกลืนดีเอ็นเอต่างถิ่น. อย่างไรก็ตาม, ความสามารถนี้สามารถถูกเหนี่ยวนำให้เกิดในเชื้อแบคทีเรียอื่นผ่านความเครียด (เช่นช็อกด้วยความร้อนหรือไฟฟ้า), จึงเป็นการเพิ่มความสามารถในการซึมผ่านของเยื่อหุ้มเซลล์ให้กับดีเอ็นเอ, ดีเอ็นเอที่ถูกดูดกลืนสามารถรวมเข้ากับจีโนมหรือมีอยู่เป็นดีเอ็นเอแบบหลายโครโมโซม (อังกฤษ: extrachromosomal DNA). ดีเอ็นเอถูกแทรกโดยทั่วไปเข้าสู่เซลล์สัตว์โดยใช้ microinjection, ที่มันสามารถถูกฉีดผ่านเปลือกนิวเคลียร์ของเซลล์โดยตรงเข้าสู่นิวเคลียสหรือผ่านการใช้ viral vectors[63]. ในพืช, ดีเอ็นเอถูกแทรกโดยทั่วไปโดยใช้การรวมแบบพึ่งพาแบคทีเรียเกษตร (อังกฤษ: Agrobacterium-mediated recombination) หรือ biolistics(การฉีดเซลล์ด้วย gene gun)[64].

ในการรวมแบบพึ่งพาแบคทีเรียเกษตร, โครงสร้างพลาสมิดจะประกอบด้วย Transfer DNA (T-DNA), ดีเอ็นเอซึ่งเป็นผู้รับผิดชอบสำหรับการแทรกของดีเอ็นเอเข้าสู่จีโนมพืชเจ้าภาพ. พลาสมิดนี้จะถูกแปลงให้เป็น "Agrobacterium" ที่ไม่มีพลาสมิดก่อนที่จะติดเชื้อเซลล์พืช. Agrobacterium จากนั้นโดยธรรมชาติจะแทรกสารพันธุกรรมเข้าไปในเซลล์พืช[65]. ในการแปลงแบบ biolistics, อนุภาคของทองหรือทังสเตนจะถูกเคลือบด้วยดีเอ็นเอจากนั้นจะถูกยิงเข้าไปในเซลล์พืชอ่อนหรือตัวอ่อนของพืช. บางสารพันธุกรรมจะเข้าสู่เซลล์และแปลงพวกมัน. วิธีการนี้สามารถนำมาใช้กับพืชที่ไม่ไวต่อการติดเชื้อ Agrobacterium และยังช่วยในการแปลงของ plastids พืช. วิธีการอีกวิธีหนึ่งสำหรับเซลล์พืชและสัตว์คือ Electroporation. Electroporation เกี่ยวข้องการช๊อคด้วยไฟฟ้ากับเซลล์พืชหรือสัตว์, ซึ่งสามารถทำให้เยื่อหุ้มเซลล์สามารถดูดซึมเข้าไปในพลาสมิดดีเอ็นเอ. ในบางกรณีเซลล์ที่ถูก electroporated จะรวมดีเอ็นเอเข้าไปในจีโนมของพวกมัน. เนื่องจากความเสียหายที่เกิดจากเซลล์และดีเอ็นเอ, ประสิทธิภาพการแปลงของ biolistics และ electroporation จะต่ำกว่าการแปลงแบบ agrobacterial mediated และ แบบ microinjection[66].

เนื่องจากบ่อยๆที่เพียงเซลล์เดียวเท่านั้นจะถูกแปลงด้วยสารพันธุกรรม, สิ่งมีชีวิตจะต้องถูกสร้างขึ้นใหม่จากเซลล์เดียวอันนั้น. เมื่อแบคทีเรียประกอบด้วยเซลล์เดียวและถูกผลิตใหม่ (อังกฤษ: reproduce) แบบโคลนิง, การสร้างขึ้นใหม่ (อังกฤษ: regeneration) จึงไม่จำเป็น. ในพืช สิ่งนี้สามารถทำได้โดยการใช้การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ. พืชแต่ละสปีซีส์จะมีความต้องการที่แตกต่างกันสำหรับการ regeneration ที่ประสบความสำเร็จผ่านการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ. หากประสบความสำเร็จ, พืชผู้ใหญ่จะผลิตสิ่งที่ประกอบด้วยสิ่งดัดแปรพันธุกรรมในทุกๆเซลล์. ในสัตว์, มันมีความจำเป็นเพื่อให้แน่ใจว่าดีเอ็นเอที่ถูกแทรกจะปรากฏในเซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อน (อังกฤษ: embryonic stem cells). Selectable markers จะถูกใช้เพื่อง่ายต่อการแยกความแตกต่างของเซลล์ที่แปลงกับเซลล์ที่ไม่ถูกแปลง. markers เหล่านี้มักจะปรากฏในสิ่งมีชีวิตดัดแปรพันธุกรรม, แม้ว่าหลายกลยุทธ์ได้รับการพัฒนาที่สามารถลบ selectable marker ออกจากพืชดัดแปรพันธุกรรมผู้ใหญ่[67]. เมื่อลูกหลานถูกผลิต, พวกมันสามารถได้รับการคัดเลือกเพื่อหาการปรากฏตัวของยีน. ลูกหลานทั้งหมดจากรุ่นแรกจะเป็น heterozygous สำหรับยีนที่ถูกแทรกและจะต้องผสมพันธ์กันเพื่อผลิตสัตว์ homozygous.

การทดสอบเพิ่มเติมใช้วิธี polymerase chain reaction (PCR), Southern hybridization, และ DNA sequencing จะถูกดำเนินการเพื่อยืนยันว่าสิ่งมีชีวิตมียีนใหม่. การทดสอบเหล่านี้ยังสามารถยืนยันสถานที่ตั้งของโครโมโซมและคัดลอกหมายเลขของยีนที่ถูกแทรกอีกด้วย. การปรากฏตัวของยีนไม่ได้รับประกันว่ามันจะมีการแสดงออกในระดับที่เหมาะสมหรือไม่ในเนื้อเยื่อเป้าหมายดังนั้นวิธีการที่จะมองหาและวัดผลิตภัณฑ์ยีน (อาร์เอ็นเอและโปรตีน) ยังมีการใช้อีกด้วย. เหล่านี้รวมถึง northern hybridization, quantitative RT-PCR, Western blot, immunofluorescence, ELISA และการวิเคราะห์แบบ phenotype. สำหรับการแปลงที่เสถียร, ยีนควรจะถูกส่งผ่านไปยังลูกหลานในรูปแบบการถ่ายทอดทางพันธุกรรมของเมนเดล (อังกฤษ: Mendelian inheritance) เพื่อที่ว่าลูกหลานของสิ่งมีชีวิตจะได้ถูกศึกษาด้วย.

การแก้ไขจีโนม

บทความหลัก: การแก้ไขจีโนม

การแก้ไขจีโนมเป็นชนิดของพันธุวิศวกรรมในการที่ดีเอ็นเอจะถูกแทรก, ถูกแทนที่, หรือถูกเคลื่อนย้ายออกจากจีโนมโดยใช้ nucleases วิศวกรรมเทียม, หรือ "กรรไกรโมเลกุล". nucleases จะสร้างการแบ่งเกลียวคู่ (อังกฤษ: double-stranded break (DSBs)) ที่เฉพาะในสถานที่ที่ต้องการในจีโนม, และใชประโยชน์ของกลไกภายใน (อังกฤษ: endogenous mechanisms) ของเซลล์เพื่อซ่อมแซมการแบ่งที่เกิดจากกระบวนการทางธรรมชาติของการรวมตัวกันอีกแบบคล้ายคลึงกัน (อังกฤษ: homologous recombination (HR)) และการเชื่อมปลายแบบไม่คล้ายคลึงกัน (อังกฤษ: nonhomologous end-joining (NHEJ)). ปัจจุบันมีสี่ครอบครัวของ nucleases วิศวกรรมคือ:. meganucleases, zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nuclease (TALENs) และ CRISPRs[68][69].