ในระหว่างปี พ.ศ. 2092 - 2106 สมเด็จพระมหาจักรพรรดิโปรดให้ปรับปรุงกิจการทหาร และเสริมสร้างบ้านเมืองให้มั่นคงแข็งแรงกว่าเดิม ยุทธศาสตร์ในการป้องกันคือ ใช้พระนครเป็นที่มั่น

• เมื่อ พ.ศ. 2092 ทรงให้ก่อกำแพงพระนครศรีอยุธยาก่ออิฐถือปูนตามแบบฝรั่งเป็นครั้งแรก จากเดิมที่ถมดินเป็นเชิงเทินแล้วปักเสาไม้ระเนียดด้านบน
• โปรดให้รื้อกำแพงเมืองหน้าด่านชั้นนอกออก 3 เมืองคือ สุพรรณบุรี ลพบุรี และนครนายก เพื่อป้องกันไม่ให้ข้าศึกอาศัยเป็นที่ตั้งมั่น
• โปรดให้ขุดคลองมหานาคเป็นคูเมืองออกไปถึงชายทุ่งภูเขาทอง คาดว่าเริ่มขุดตั้งแต่ศึกพระสุริโยทัยขาดคอช้างแต่เพิ่งมาเสร็จ
• โปรดให้สำรวจบัญชีสำมะโนครัวใหม่ ตามหัวเมืองชั้นในทุกหัวเมือง ทำให้ทราบจำนวนชายฉกรรจ์ที่สามารถทำการรบได้
• ทรงตั้งเมืองใหม่ขึ้น 3 เมือง เพื่อให้เป็นที่รวมพลและง่ายต่อการเกณฑ์เข้าพระนคร
  • ยกตลาดขวัญเป็น เมืองนนทบุรี
  • ยกบ้านท่าจีนเป็น เมืองสาครบุรี
  • แบ่งเอาเขตเมืองราชบุรีกับเมืองสุพรรณบุรีเป็น เมืองนครชัยศรี
• พ.ศ. 2095 โปรดให้แปลงเรือแซ (เรือยาวตีกรรเชียง ใช้คนพาย ประมาณ 20 คน) เป็นเรือชัย (เรือที่มีปืนใหญ่ยิงได้ที่หัวเรือ) และหัวสัตว์ คือการพัฒนาเรือรบนั่นเอง ซึ่งก็คือเรือที่ใช้ในพระราชพิธีปัจจุบัน
• โปรดให้จับช้างเข้ามาใช้ในราชการ สมเด็จพระมหาจักรพรรดิทรงสามารถจับช้างเผือกได้ถึงเจ็ดเชือก จึงได้รับขนานพระนามว่า พระเจ้าช้างเผือก อีกพระนามหนึ่ง

พ.ศ. 2106 สมเด็จพระไชยเชษฐาธิราช แห่งอาณาจักรล้านช้าง มีพระราชประสงค์เป็นไมตรีกับกรุงศรีอยุธยา จึงส่งทูตมาขอพระเทพกษัตรี พระราชธิดาพระองค์เล็กไปเป็นพระชายา สมเด็จพระมหาจักรพรรดิทรงรับไมตรีแต่ตอนนั้นพระเทพกษัตรีทรงพระประชวร พระองค์จึงส่งพระแก้วฟ้าไปถวายแทน

เมื่อพระไชยเชษฐาทรงทราบว่าไม่ใช่พระเทพกษัตรีจึงถวายพระแก้วฟ้าคืนใน พ.ศ. 2107 สมเด็จพระมหาจักรพรรดิจึงทรงส่งพระเทพกษัตรีย์ไปยังล้านช้างแต่พระเจ้าบุเรงนองทรงทราบเข้าจึงส่งทหารไปชิงตัวพระเทพกษัตรีมา

สมเด็จพระมหาจักรพรรดิทรงทราบก็ทรงเสียพระทัย จึงเสด็จไปประทับที่วังหลัง ให้พระมหินทร์พระโอรสว่าราชการแทน เมื่อพระชนมายุประมาณ 59 พรรษา ต่อมาได้เสด็จออกผนวชใน พ.ศ. 2109 โดยมีข้าราชการออกบวชด้วยจำนวนมาก

พระมหินทร์ ทรงได้ว่าราชการแทนในช่วงหนึ่ง ต่อมาทรงมีเรื่องกินแหนงแคลงใจกับพระมหาธรรมราชา จนเกิดความร้าวฉานระหว่างพิษณุโลกกับกรุงศรีอยุธยาเนื่องจากพระองค์สมคบพระไชยเชษฐาไปตีเมืองพิษณุโลก จนพระองค์มิอาจรั้งราชการแผ่นดินจึงทูลเชิญให้สมเด็จพระมหาจักรพรรดิลาผนวชหลังจากที่ผนวชได้ไม่นาน แล้วกลับมาว่าราชการตามเดิม

พระองค์กับพระมหินทร์เสด็จขึ้นไปเมืองพิษณุโลก ขณะที่พระมหาธรรมราชาเสด็จไปหงสาวดีแล้วนำพระวิสุทธิกษัตรีพร้อมด้วยพระเอกาทศรถมาอยู่ที่กรุงศรีอยุธยา เมื่อพระมหาธรรมราชาทราบเรื่องจึงให้ไปเข้ากับหงสาวดีอย่างเปิดเผย

เมื่อ พ.ศ. 2111 ระหว่างสงครามกับอาณาจักรตองอู สมเด็จพระมหาจักรพรรดิทรงพระประชวรหนักประมาณ 25 วัน และเสด็จสวรรคตในขณะที่ทัพพม่าดีปิดล้อมกรุงศรีอยุธยาอยู่ รวมพระชนมายุ 57 พรรษา ครองสิริราชสมบัติได้ 20 ปี