โรงเรียนมหิดลวิทยานุสรณ์มีระบบการคัดเลือกนักเรียน ที่ดำเนินการโดยบุคลากรของโรงเรียนเอง เพื่อคัดเลือกนักเรียนที่เหมาะสมที่สุดสำหรับเป้าหมายของโรงเรียน ในอดีต การสอบคัดเลือกนักเรียนเข้าโรงเรียนทำควบคู่ไปกับการคัดเลือกนักเรียนเข้าโครงการ พสวท. จนถึงรุ่นที่ 16 หรือรุ่นที่เข้าปีการศึกษาพ.ศ. 2549 โดยมีการสอบแบ่งเป็น 2 รอบ โดยในรอบแรกเป็นข้อสอบประเภทข้อเขียน ซึ่งมีทั้งข้อสอบประเภทปรนัยและอัตนัย ส่วนในรอบที่สองนั้น จนถึงรุ่น 17 หรือรุ่นที่เข้าปีการศึกษาพ.ศ. 2550 เป็นการสอบพร้อมกับการเข้าค่ายที่โรงเรียนมหิดลวิทยานุสรณ์ โดยมีทั้งการสอบข้อเขียนแบบอัตนัย และการฟังบรรยายแล้วสอบจากเรื่องที่บรรยาย รวมถึงมีการให้นักเรียนได้เข้าใช้ห้องปฏิบัติการของทั้งสาขาวิชาชีววิทยา เคมี และฟิสิกส์ ทั้งนี้ มีจุดประสงค์เพื่อให้นักเรียนได้เข้าใจถึงชีวิตความเป็นอยู่ของนักเรียนหอพัก เพื่อช่วยในการตัดสินใจ รวมถึงเป็นการวัดความสามารถในการเรียนรู้ ที่ไม่สามารถเตรียมมาล่วงหน้าได้ อย่างไรก็ตาม จากรุ่น 18 หรือรุ่นที่เข้าปีการศึกษาพ.ศ. 2551 เป็นต้นไป เนื่องจากได้ปรับเปลี่ยนระบบการคัดเลือกนักเรียน ให้สามารถใช้ร่วมกับการคัดเลือกนักเรียนเข้าโรงเรียนวิทยาศาสตร์จุฬาภรณราชวิทยาลัยทั้ง 12 แห่ง และโครงการ วมว. จึงมีการปรับใช้การอ่านบทความแทนการฟังบรรยาย และเปลี่ยนให้การเข้าร่วมค่ายที่โรงเรียนมหิดลวิทยานุสรณ์เป็นไปตามความสมัครใจแทน

การคัดเลือกนักเรียนเข้าเรียนที่โรงเรียนมหิดลวิทยานุสรณ์ถือว่ามีความเข้มข้นสูงมาก โดยปกติแล้วตั้งแต่รุ่น 17 เป็นต้นมา มีนักเรียนมาสมัครเข้ารับการคัดเลือกประมาณ 20,000 คน สถิตินักเรียนสมัครเข้าเรียนที่โรงเรียนมหิดลวิทยานุสรณ์สำหรับรุ่นที่เข้าปีการศึกษาพ.ศ. 2562 มีจำนวน 22,321 คน[2]โดยโรงเรียนจะทำการคัดเลือกเพื่อเข้าเรียนเป็นจำนวน 240 คน โดยนักเรียนที่ได้คะแนนเท่ากันเป็นอันดับสุดท้าย ทางโรงเรียนจะรับเข้าศึกษาด้วย