โรงเรียนพัฒนาหลักสูตรขึ้นใช้เป็นการเฉพาะกับนักเรียนของโรงเรียนมีการปรับปรุงหลักสูตรทุก 3 ปี โดยมีผู้ทรงคุณวุฒิสาขาต่าง ๆ จากสถาบันอุดมศึกษาเป็นที่ปรึกษาในการพัฒนาหลักสูตร โดยมุ่งเน้นการพัฒนานักเรียน รอบด้าน ทั้งพุทธิศึกษา จริยศึกษา พลศึกษา และหัตถศึกษา รายวิชาพื้นฐานครอบคลุมหลักสูตรการศึกษาขั้น พื้นฐานของกระทรวงศึกษาธิการนอกจากนี้ยังจัดสาระการเรียนรู้รายวิชาเพิ่มเติมให้หลากหลาย สอดคล้องกับ ศักยภาพ ความถนัดและความสนใจของนักเรียนเป็นรายบุคคลมีการจัดกิจกรรมพัฒนาผู้เรียนทั้งภายในและ ภายนอกห้องเรียน เพื่อมุ่งสร้างความเป็นพหุปัญญาสร้างเสริมประสบการณ์การเรียนรู้ เปิดโลกทัศน์ที่กว้างไกลของ นักเรียน และ เพื่อให้เกิดความสมดุลทั้งความรู้ ความคิด ความดีงาม และความรับผิดชอบต่อสังคม[10]

ปัจจุบันโรงเรียนมหิดลวิทยานุสรณ์ใช้หลักสูตรโรงเรียนมหิดลวิทยานุสรณ์ พุทธศักราช 2562 ซึ่งเป็นการปรับปรุงหลักสูตรครั้งที่ 6 โดยปรับปรุงหลักสูตรให้มีความใกล้เคียงเนื้อหาของ สอวน. โรงเรียนมหิดลวิทยานุสรณ์ได้เพิ่มรายวิชาทักษะชีวิต เพื่อพัฒนาทักษะการใช้ชีวิตในหอพักและทำให้นักเรียนเติบโตเป็นบุคลากรที่มีความสามารถและอยู่ร่วมกันในสังคมอย่างมีความสุข และเพิ่มรายวิชาสัมมนาวิทยาศาสตร์ รายวิชาธรรมชาติและการสืบเสาะอย่างวิทยาศาสตร์ (Nature of Science and Scientific Inquiry)[11]และรายวิชาโครงงานวิทยาศาสตร์ เพื่อพัฒนากระบวนการคิด และกระบวนการสืบเสาะค้นหาองค์ความรู้ หาคำตอบของข้อสงสัย ของปัญหาที่อยากรู้ โดยใช้กระบวนการทางวิทยาศาสตร์ (Scientific Methods) เช่นเดียวกับที่นักวิทยาศาสตร์ นักวิจัย หรือนักประดิษฐ์คิดค้นใช้ในกระบวนการทำงานของตนเอง รวมถึงการพัฒนาทักษะในการทำวิจัย (โครงงาน) อย่างครบวงจร และปลูกฝังจิตวิญญาณและความรู้ความสามารถในการเป็นนักคิดค้น นักวิจัยในภายภาคหน้า โดยได้รับความร่วมมือจากบุคลากรชั้นนำทั้งในประเทศและต่างประเทศ เช่น Dr. David Workman จาก Illinois Mathematics and Science Academy หลักสูตรนี้ยังส่งเสริมการพัฒนาทักษะทางภาษาต่างประเทศ คือภาษาอังกฤษ โดยมีการสอนแบบแบ่งกลุ่มนักเรียนตามคะแนนสอบและจัดการเรียนการสอนให้เหมาะสมกับระดับความสามารถ รวมถึงเปิดการสอนภาษาอื่นๆอีกอย่างน้อย 4 ภาษา คือ ภาษาจีน ภาษาญี่ปุ่น ภาษาฝรั่งเศส ภาษาเยอรมัน โดยในบางครั้งหากมีบุคลากรที่เหมาะสมจะเปิดการเรียนการสอนภาษาอื่น ๆ ด้วย เช่น ในอดีตเคยมีการเปิดสอนภาษาเกาหลี และภาษารัสเซีย การสอนภาษาต่างประเทศนี้ มีจุดประสงค์เพื่อสร้างความเป็นสากลให้เกิดขึ้นในบุคลากรของชาติในอนาคตและเพื่อยกระดับความเป็นโรงเรียนวิทยาศาสตร์ให้ทัดเทียมกับโรงเรียนวิทยาศาสตร์ชั้นนำของโลก (World Class)