ความแตกต่างระหว่างแอนน์และพระเจ้าเจมส์อีกเรื่องหนึ่งคือเรื่องศาสนาเช่นในการที่แอนน์ไม่ทรงยอมรับศีลมหาสนิทแบบอังกลิคันในพระราชพิธีราชาภิเษกเป็นราชินีของพระองค์เอง[89] แอนน์ทรงได้รับการเลี้ยงดูมาอย่างลูเธอรันแต่อาจจะทรงเปลี่ยนเป็นนิกายโรมันคาทอลิกอย่างลับๆ ในเวลาใดเวลาหนึ่ง ซึ่งเป็นสถานการณ์ทางการเมืองที่ถ้าเป็นที่เปิดเผยก็จะเป็นสิ่งที่น่าละอาย และเป็นที่ทำให้หวาดหวั่นกันในบรรดาองค์มนตรีของสกอตแลนด์ ของวัดสกอตแลนด์ และทำให้เป็นที่น่าสงสัยแก่หมู่อังกลิคันของอังกฤษ[90]

พระราชินีนาถเอลิซาเบธเองก็ทรงเป็นกังวลเรื่องโอกาสที่จะเปลี่ยนนิกายของแอนน์จนทรงส่งพระราชสาส์นไปเตือนแอนน์ไม่ให้ฟังที่ปรึกษาโรมันคาทอลิก และขอให้ส่งชื่อผู้ที่จะพยายามให้พระองค์เปลี่ยนศาสนามาให้พระองค์ แอนน์ทรงตอบไปว่าไม่มีความจำเป็นในการส่งชื่อเพราะความพยายามต่างๆ ต่างก็ล้มเหลว[91] แต่แอนน์ก็ถูกวิจารณ์จากนิกายเชิร์ชออฟสกอตแลนด์ที่ยังคงเป็นสหายสนิทของเฮ็นเรียตตา กอร์ดอนภรรยาของจอร์จ กอร์ดอน มาร์ควิสแห่งฮันท์ลีย์ที่ 1 (George Gordon, 1st Marquess of Huntly) [92] หลังจากจอร์จ กอร์ดอน มาร์ควิสแห่งฮันท์ลีย์กลับมาในปี ค.ศ. 1596 นักบวชเดวิด แบล็คแห่งวัดเซนต์แอนดรูว์เรียกแอนน์ว่า “atheist” (ผู้ไม่เชื่อพระเจ้า) และเปรยในคำเทศนาว่า “พระราชินีแห่งสกอตแลนด์เป็นสตรีที่แม้นักบวชจะสวดมนต์ให้พรให้พระองค์แต่ก็ไม่มีโอกาสที่จะทำให้มีผลดีขึ้นแต่อย่างใด”[93]

เมื่ออดีตสายลับเซอร์แอนโทนี สแตนเด็นถูกพบว่าเป็นผู้นำสายประคำจากสมเด็จพระสันตะปาปาคลีเมนต์ที่ 8 มาถวายแอนน์ในปี ค.ศ. 1603 พระเจ้าเจมส์ก็ทรงสั่งให้จับสแตนเด็นไปจำขังไว้ที่หอคอยแห่งลอนดอนอยู่สิบเดือน[94] แอนน์ทรงประท้วงเรื่องของขวัญ และในที่สุดก็ทรงช่วยให้สแตนเด็นได้รับการปลดปล่อย[79]

พระราชินีแอนน์ก็เช่นเดียวกับพระเจ้าเจมส์ที่ทรงสนับสนุนการจัดคู่ของทั้งพระราชโอรสและธิดากับผู้เป็นโรมันคาทอลิก แอนน์มีพระราชสาส์นถึงผู้ที่อาจจะมาเป็นเจ้าสาวของพระโอรสเจ้าหญิงมาเรียแอนนาแห่งสเปนที่รวมทั้งทรงขอให้มาเรียแอนนาส่งนักบวชสองคนไปเยรูซาเลมเพื่อไปสวดมนต์ให้พระองค์และพระเจ้าเจมส์[95] ทางสำนักพระสันตะปาปาไม่เคยมีความมั่นใจในสถานะของแอนน์ ในปี ค.ศ. 1612 สมเด็จพระสันตะปาปาปอลที่ 5 ทรงแนะนำทูตของราชสำนักว่า “อย่าเอาความลมเพลมพัดของพระองค์มาเป็นหลัก ...และแม้ว่าจะทรงเป็นโรมันคาทอลิกจริงก็ยังเอามาเป็นการตัดสินที่แน่นอนไม่ได้”[96]