การวินิจฉัยยืนยันของโรคเมลิออยด์นั้นทำโดยการเพาะเชื้อจากร่างกาย เนื่องจากโดยปกติแล้วจะไม่พบเชื้อดังกล่าวในร่างกายมนุษย์

ประวัติการสัมผัสดินอาจไม่สามารถซักจากผู้ป่วยได้ เนื่องจากโรคเมลิออยด์อาจแฝงอยู่เป็นเวลาหลายปีกว่าจะแสดงอาการ[49] สำหรับผู้ที่อยู่นอกแหล่งที่โรคเมลิออยด์เป็นโรคประจำถิ่นควรซักประวัติการเดินทางไปยังบริเวณที่พื้นที่เฉพาะถิ่นของโรคเมลิออยด์ บางแหล่งข้อมูลแนะนำให้คิดถึงความเป็นไปได้ที่จะติดเชื้อเมลิออยด์ ในผู้ป่วยทุกรายที่มีประวัติเดินทางไปยังหรืออาศัยอยู่ในแหล่งที่โรคเมลิออยด์เป็นโรคประจำถิ่น

การตรวจคัดกรองการติดเชื้อทุกส่วน ไม่ว่าจะเป็นการเพาะเชื้อจากเลือด เพาะเชื้อจากปัสสาวะ การป้ายคอมาตรวจ และการเพาะเชื้อจะหนองที่ดูดมาได้ ควรทำในผู้ป่วยทุกรายที่สงสัยการติดเชื้อโรคเมลิออยด์ (โดยเพาะเชื้อใน blood agar หรือ Ashdown's medium) ซึ่งสามารถยืนยันการวินิจฉัยโดยการเพาะเชื้อพบ B. pseudomallei จากตัวอย่างใดก็ได้ที่เก็บมา การป้ายคออาจไม่มีความไว (sensitivity) แต่ให้ความจำเพาะ (specificity) ถึง 100% หากให้ผลบวก โดยเฉพาะอย่างยิ่งหากผลเพาะเชื้อจากเสมหะเป็นบวกด้วย[50] ความไวของการเพาะเชื้อจากปัสสาวะจะยิ่งเพิ่มขึ้นหากเพาะเชื้อจากปัสสาวะที่ปั่นเหวี่ยง (centrifuged) และหากผลเพาะเชื้อขึ้นก็นับเป็นผลบวกไม่ว่าจะมีปริมาณเชื้อเท่าใดก็ตาม (ไม่จำเป็นต้องใช้เกณฑ์ทั่วไปที่ปริมาณเชื้อมากกว่า 104 ต่อมิลลิลิตร) [51] ในบางครั้งการเพาะเชื้อจากไขกระดูกอาจให้ผลบวกในผู้ป่วยที่ผลเพาะเชื้อ B. pseudomallei เป็นลบ แต่ก็ไม่แนะนำให้ทำ[52] ข้อผิดพลาดของแพทย์ที่อาจไม่คุ้นเคยกับโรคนี้คือ การส่งตัวอย่างเฉพาะจากอวัยวะที่ติดเชื้อไปตรวจเท่านั้น แทนที่จะส่งตัวอย่างคัดกรองทุกส่วนดังที่กล่าวมาตอนต้น

ตัวกลางเพาะเชื้อ Ashdown's medium เป็นตัวกลางที่มียาปฏิชีวนะเจนตามัยซิน (gentamicin) ซึ่งจำเป็นในการเพาะเชื้อจากส่วนที่ไม่ปราศจากเชื้อ (non-sterile sites) ตัวกลางเพาะเชื้อ Burkholderia cepacia medium อาจเป็นตัวเลือกที่ใช้เพาะเชื้อได้ในบริเวณที่ไม่ใช่พื้นที่โรคเมลิออยด์เป็นโรคประจำถิ่นหากไม่มี Ashdown's medium ให้ใช้ ตัวกลางเพาะเชื้อชนิดใหม่ซึ่งพัฒนามาจาก Ashdown's medium ชื่อว่า Francis medium อาจช่วยในการแยกระหว่างเชื้อ B. pseudomallei กับ B. cepacia และอาจช่วยในการวินิจฉัยโรคเมลิออยด์ได้ในระยะแรก[53] แต่ก็ยังไม่มีการยอมรับกันทางคลินิกอย่างกว้างขวาง ชุดตรวจเพื่อยืนยันเชื้อแบคทีเรียสำเร็จรูปหลายตัวอาจไม่สามารถระบุเชื้อ B. pseudomallei ได้อย่างถูกต้อง

การทดสอบทางวิทยาน้ำเหลือง (serology) สำหรับเชื้อเมลิออยด์ เช่น การทดสอบปริมาณการเกาะกลุ่มของเม็ดเลือดแดงทางอ้อม (indirect haemagglutination assay) แต่อาจไม่สามารถทำได้ในหลายประเทศ ในประเทศที่โรคนี้เป็นโรคประจำถิ่นประชากรมี titre สูงอยู่แล้วทำให้ค่าพยากรณ์ผลบวก (positive predictive value) ลดลง การทดสอบเชื้อที่นิยมกันแพร่หลายในประเทศไทยคือการทดสอบอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์โดยตรงจำเพาะ (direct immunofluorescent test) และการเกาะกลุ่มลาเท็กซ์ (latex agglutination) โดยอาศัยสารภูมิต้านทานโมโนโคลน (monoclonal antibodies) แต่การทดสอบนี้ไม่มีที่ใช้ในประเทศอื่น อิมมูโนฟลูออเรสเซนต์โดยตรงมีปฏิกิริยาข้าม (cross-reactivity) เกือบสมบูรณ์กับ B. thailandensis[54]

การวินิจฉัยโรคเมลิออยด์ไม่สามารถทำได้โดยอาศัยวิธีทางรังสี (เอกซเรย์และสแกน) เท่านั้น[55] แต่วิธีการทางรังสีมักถูกใช้เป็นประจำเพื่อประเมินความรุนแรงของโรค[56] แนะนำให้ทำภาพรังสีของช่องท้องโดยเอกซเรย์คอมพิวเตอร์หรือตรวจคลื่นเสียงความถี่สูง เนื่องจากฝีของอวัยวะภายในอาจไม่ได้แสดงอาการทางคลินิกออกมาชัดเจน และอาจพบฝีเกิดร่วมกับโรคที่บริเวณอื่น ในประเทศออสเตรเลียแนะนำให้ทำภาพรังสีเพื่อตรวจต่อมลูกหมากเนื่องจากมีอุบัติการณ์ของฝีที่ต่อมลูกหมากสูงในผู้ป่วยทางตอนเหนือของออสเตรเลีย การทำเอกซเรย์ทรวงอกแนะนำให้ทำเป็นประจำ ร่วมกับการตรวจเพิ่มเติมอื่น ๆ ตามอาการแสดงทางคลินิก การปรากฏฝีที่ตับลักษณะเป็นรังผึ้ง (honeycomb abscesses) เป็นลักษณะของการติดเชื้อเมลิออยด์ที่ตับ แต่ภาพที่เห็นไม่ได้บ่งถึงการวินิจฉัย[55][56]

การวินิจฉัยแยกโรคนั้นมีได้กว้างเนื่องจากโรคเมลิออยด์อาจแสดงลักษณะทางคลินิกเลียนแบบการติดเชื้ออื่น ๆ รวมทั้งวัณโรค[47]