ตรามหาวิทยาลัย เมื่อมีการสถาปนามหาวิทยาลัยแพทยศาสตร์ขึ้นเมื่อ พ.ศ. 2486 ทางมหาวิทยาลัยได้ใช้ตราวงกลม 2 ชั้น ภายในเป็นรูปงูพันคบเพลิง วงนอกด้านบนเขียนว่า "อตฺตานํ อุปมํ กเร" ด้านล่างเขียนว่า "มหาวิทยาลัยแพทยศาสตร์" เป็นตราประจำมหาวิทยาลัยเรื่อยมา

จนกระทั่ง ปี พ.ศ. 2512 พระบาทสมเด็จพระเจ้าอยู่หัวภูมิพลอดุลยเดชพระราชทานชื่อ "มหาวิทยาลัยมหิดล" เป็นชื่อมหาวิทยาลัยแทนชื่อเดิม ดังนั้น มหาวิทยาลัยจึงได้เปลี่ยนตราสัญลักษณ์ใหม่ โดยให้นายแพทย์นันทวัน พรหมผลิน เป็นผู้ออกแบบและอาจารย์กอง สมิงชัย เป็นผู้ช่วยร่างแบบ เมื่อออกแบบเสร็จแล้วจึงนำเสนอทูลเกล้าฯ เพื่อขอพระบรมราชวินิจฉัย ซึ่งพระบาทสมเด็จพระเจ้าอยู่หัวทรงพระกรุณาโปรดเกล้าฯ พระราชทานแก่หม่อมราชวงศ์มิตรารุณ เกษมศรี สถาปนิกพิเศษประจำสำนักพระราชวัง ในการปรับแก้ไขตรีและพระมหามงกุฏของตราให้เป็นแบบไทยและพระราชทานตราให้แก่มหาวิทยาลัยมหิดลเมื่อวันที่ 29 กรกฎาคม พ.ศ. 2512[18] ซึ่งมีลักษณะเป็นวงกลม 2 ชั้น โดยวงกลมชั้นในมีพื้นหลังเป็นสีน้ำเงิน ตรงกลางเป็นตราประจำราชสกุลมหิดลสีเหลืองทอง ส่วนวงกลมชั้นนอกนั้นมีพื้นหลังสีขาวตัวอักษรสีเหลืองทองด้านบนเขียนว่า "อตฺตานํ อุปมํ กเร" ด้านล่างเขียนว่า "มหาวิทยาลัยมหิดล" คั่นด้วยดอกประจำยามสีเหลืองทอง[19]

สีประจำมหาวิทยาลัย ได้แก่ สีน้ำเงิน เป็นสีแห่งความเป็นราชขัติยนุกูลแห่งบรมราชวงศ์ ซึ่งสมเด็จพระศรีนครินทราบรมราชชนนี พระราชทานเมื่อวันที่ 23 มิถุนายน พ.ศ. 2512[20]

ต้นไม้ประจำมหาวิทยาลัย ได้แก่ ต้นกันภัยมหิดล ซึ่ง สมเด็จพระเจ้าพี่นางเธอ เจ้าฟ้ากัลยาณิวัฒนา กรมหลวงนราธิวาสราชนครินทร์ ประทานพระราชวินิจฉัยชี้ขาดให้ "ต้นกันภัยมหิดล" เป็นต้นไม้สัญลักษณ์ประจำมหาวิทยาลัยมหิดล เมื่อวันที่ 19 กุมภาพันธ์ พ.ศ. 2542[21]